АСТМ А790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплекс заварена цев за хемијску компоненту хемијске индустрије, недостатак СПЕЦЦ1Л доводи до повећане стабилности спојених спојева и смањеног одлагања ћелија кранијалног нервног гребена.

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.

АСТМ А790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплекс заварена цев за хемијску индустрију

Лиаоцхенг Сихе СС Материал Цо., Лтд.је водећи произвођач који је специјализован за бешавне цеви од нерђајућег челика, светле жарене цеви, бешавне намотане цеви итд.Да бисмо олакшали купце, заварили смо и цеви и цеви.Лиаоцхенг Сихе СС Материал Цо., Лтд.има најнапреднију опрему за производњу и тестирање.Можемо у потпуности задовољити ваше захтеве.Према веома стриктно стандарду, цеви које производимо увек имају тачну толеранцију ОД и ВТ.Контрола толеранције је стриктно у складу са стандардима производње.Наши производи су увек задовољни купцима.Купци који су куповали наше производе створили су већи профит.
а) ОД (спољни пречник): 3,18 мм до 101,6 мм
б) ВТ (дебљина зида): 0,5 мм до 20 мм
ц) Дужина: према захтеву купца
д) Стандарди: АСТМ А312;АСТМ А269;АСТМ А789;АСТМ А790 итд
е) Метода процеса: ЕРВ, ЕФВ итд

Клизачи који приказују три чланка по слајду.Користите дугмад назад и следећи да бисте се кретали кроз слајдове или дугмад контролора слајдова на крају да бисте се кретали кроз сваки слајд.
Ћелије кранијалног неуралног гребена (ЦНЦЦ) одвајају се од ембрионалних неуралних набора и мигрирају у фарингеалне лукове, који формирају већину структура средњег дела лица.Дисфункција ЦНЦЦ игра важну улогу у етиологији орофацијалног расцепа, уобичајене урођене малформације.Хетерозиготне СПЕЦЦ1Л мутације су пронађене код пацијената са атипичним и синдромским расцепима.Овде извештавамо о побољшаном бојењу компоненти канонског адхезивног споја (АЈ), β-катенина и Е-кадхерина у култивисаним ћелијама за уништавање СПЕЦЦ1Л, а електронске микрографије показују апикално-базалну дифузију АЈ.Да бисмо разумели улогу СПЕЦЦ1Л у краниофацијалној морфогенези, креирали смо модел миша са недостатком Спецц1л.Хомозиготни мутанти су ембрионално смртоносни и показују оштећено затварање неуралне цеви и ЦНЦЦ ламинацију.Бојење АЈ протеина је повећано у мутантним неуралним наборима.Овај АЈ дефект је у складу са дефектом у ЦНЦЦ деламинацији, што захтева растварање АЈ.Поред тога, Спецц11 мутанти имају смањену ПИ3К-АКТ сигнализацију и повећану апоптозу.Ин витро, блага инхибиција ПИ3К-АКТ сигнализације у ћелијама дивљег типа била је довољна да изазове промене АЈ.Важно је да се промене АЈ изазване срушењем СПЕЦЦ1Л могу преокренути активацијом ПИ3К-АКТ пута.Узети заједно, ови подаци сугеришу да је СПЕЦЦ1Л, као нови регулатор ПИ3К-АКТ сигнализације и АЈ биологије, неопходан за затварање неуралне цеви и ЦНЦЦ стратификацију.
Ћелије кранијалног неуралног гребена (ЦНЦЦ) локализују се на дорзалном неуроектодерму и одвајају се од неуроепитела неуралних набора у развоју кроз процес који укључује епително-мезенхимску транзицију (ЕМТ)1,2,3.Премигрирајући епителни ЦНЦЦ ометају међућелијске спојеве и постају мигрирајући мезенхимски ЦНЦЦ који испуњавају први и други фарингеални лук и формирају већину краниофацијалне хрскавице.Дакле, гени који регулишу функцију ЦНЦЦ често су поремећени у етиологији краниофацијалних конгениталних аномалија, као што су орофацијални расцепи, који најчешће погађају 1/800 рођених само у САД.Један од урођених деформитета8.
Деламинација ЦНЦЦ-а се поклапа са затварањем предње неуралне цеви између 8,5 и 9,5 дана ембрионалног развоја код мишева.Мутанти бројних гена повезаних са орофацијалним расцепом миша такође показују неки облик дефекта неуралне цеви, укључујући Ирф69,10, Гхрл310, Цфл111 и Пдгфрα12.Међутим, процеси затварања неуралне цеви и ЦНЦЦ стратификације могу се сматрати независним, пошто мутантни миш Сплотцх (Пак3) показује дефекте у затварању неуралне цеви без икаквог утицаја на ЦНЦЦ стратификацију или миграцију 13,14.Додатни модели миша са дефектима у ЦНЦЦ дисекцији и затварању неуралне цеви помоћи ће да се оцрта заједничка молекуларна основа ова два процеса.
Изолација ЦНЦЦ-а из неуроепителних ћелија захтева растварање адхезивних спојева (АЈ), који се састоје од протеинских комплекса који садрже, између осталог, Е-кадхерин, β-катенин, α-Е-катенин и α-актинин повезан са актинским филаментима 2 Студије прекомерне експресије Е-кадхерина у нервним наборима су показале смањење или кашњење у ЦНЦЦ деламинацији.Супротно томе, супресија Е-кадхерина доводи до ране стратификације15,16.Многи фактори који посредују ЕМТ током ЦНЦЦ стратификације су фактори транскрипције (АП2α, Ид2, ФОКСД3, СНАИЛ, ТВИСТ, СОКС10) и протеини ремоделирања екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ), као што су матрикс металопротеиназе (ММП), међутим ЦНЦЦ су директни регулатори цитоскела. још није познато.Познато је да пут ПИ3К-АКТ антагонизира нивое Е-кадхерина, углавном из истраживања рака17.Недавне студије су показале да губитак ПИ3К-АКТ сигнализације засноване на ПДГФα код мишева доводи до краниофацијалних абнормалности, укључујући расцеп непца и дефекте неуралне цеви12.Међутим, однос између ПИ3К-АКТ пута и стабилности АЈ након ЦНЦЦ стратификације је нејасан.
Претходно смо идентификовали СПЕЦЦ1Л као први мутантни ген код две особе са тешким расцепом који се протеже од уста до ока, познатим као коси расцеп (ОбФЦ) или Тессиер ИВ18 расцеп.СПЕЦЦ1Л мутације су идентификоване у две вишегенерацијске породице са аутозомно доминантним Опитз Г/БББ синдромом (ОМИМ #145410), у којима су погођене особе показале хипердистанцу и расцеп усне/непца19, и у једној породици са синдромом превелике удаљености Тиби (ОМИМ #140420) .више од половине случајева Опитз Г/БББ синдрома је Кс-везано (ОМИМ #300000) и узроковано је мутацијама гена МИД1, који кодира протеин 22 скелета ћелија повезаног са микротубулама.Претпостављамо да СПЕЦЦ1Л, такође протеин повезан са микротубулама и актинским цитоскелетом, може посредовати у сигнализацији потребној за ремоделирање актинског цитоскелета током ћелијске адхезије и миграције 18 .Кроз ин витро и ин виво студије, сада описујемо СПЕЦЦ1Л као нови регулатор стабилности АЈ кроз ПИ3К-АКТ сигнализацију.На ћелијском нивоу, недостатак СПЕЦЦ1Л је резултирао смањењем нивоа пан-АКТ протеина и повећањем апикално-базалне дисперзије АЈ, што је елиминисано хемијском активацијом АКТ пута.Ин виво, ембриони са недостатком Спецц11 показују оштећено затварање неуралне цеви и смањену ЦНЦЦ дисекцију.Дакле, СПЕЦЦ1Л функционише у високо регулисаној сигнализацији заснованој на ћелијској адхезији потребној за нормалну функцију ЦНЦЦ током морфогенезе лица.
Да бисмо окарактерисали улогу СПЕЦЦ1Л на ћелијском нивоу, користили смо претходно описану стабилну ћелијску линију остеосаркома У2ОС дефицитарну у СПЕЦЦ1Л18.Ове стабилне У2ОС ћелије са срушеним СПЕЦЦ1Л (кд) имале су умерено (60–70%) смањење нивоа СПЕЦЦ1Л транскрипата и протеина, заједно са дефектима у миграцији и реорганизацији актинског цитоскелета 18. Насупрот томе, озбиљно пролазно смањење у Показало се да СПЕЦЦ1Л доводи до митотичких дефеката 23 .Након даље карактеризације, открили смо да су наше стабилне СПЕЦЦ1Л-кд ћелије промениле морфологију на веома високом степену конфлуенције (Слика 1).Појединачне контролне ћелије и кд ћелије на ниском споју изгледале су слично (Слика 1А, Д).24 сата након фузије, контролне ћелије су задржале свој коцкасти облик (сл. 1Б, Е), док су се СПЕЦЦ1Л-кд ћелије издужиле (сл. 1Ц, Ф).Степен ове промене у облику ћелије ухваћен је ин виво живом сликом контролних ћелија и кд ћелија (филм 1).Да бисмо одредили улогу СПЕЦЦ1Л у конфлуентним ћелијама, прво смо испитали његову експресију.Открили смо да су се нивои протеина СПЕЦЦ1Л повећали након фузије (Слика 1Г), док се нивои СПЕЦЦ1Л транскрипта нису повећали (Слика 1Х).Поред тога, како се густина ћелија повећавала, СПЕЦЦ1Л протеин се акумулирао на међућелијским границама (слика 2А-Е), са шаблоном који се преклапа са оним β-катенина повезаног са мембраном (слика 2А'-Е').С обзиром на повезаност СПЕЦЦ1Л са актинским цитоскелетом 18,23, претпоставили смо да СПЕЦЦ1Л реагује са адхезивним спојевима на бази актина (АЈ).
(АФ) СПЕЦЦ1Л кноцкдовн (ДФ) ћелије се издужују при високом споју (Ф) у поређењу са контролним У2ОС ћелијама (АЦ).Овде су приказане три од шест временских тачака (Т1, Т3, Т6) које смо одабрали за различите густине ћелија.(Г) Вестерн блот анализа која показује да је протеин СПЕЦЦ1Л стабилизован на високом степену конфлуенције у поређењу са ниским степеном конфлуенције у контролним ћелијама.Вестерн блот СПЕЦЦ1Л показује очекивану траку од 120 кДа и траку веће молекуларне тежине, могуће пост-транслационо модификовану (*).Вестерн блот анализа је изведена под истим условима за ниску и високу конфлуентност.Слике које показују СПЕЦЦ1Л на ниском и високом ушћу су узете из исте мрље.Иста мрља је уклоњена и поново испитана антителом на β-актин.(Х) Квантитативна РТ-ПЦР анализа није показала значајне промене у нивоима СПЕЦЦ1Л транскрипта.Траке грешака представљају СЕМ из четири независна експеримента.
(АЕ) Изабрали смо шест временских тачака (Т1-Т6) које представљају опсег густине ћелија да бисмо нормализовали анализу облика ћелије и АЈ промене у У2ОС ћелијама са срушеним СПЕЦЦ1Л (кд).Првих пет од ових временских тачака укључивало је појединачне ћелије (Т1), 50-70% фузију кластера малих ћелија (Т2), фузију без преобликовања кд ћелија (Т3), преобликовање кд ћелија (Т4) и 24-часовне промене.у задњем облику кд (Т5) ћелија.СПЕЦЦ1Л протеин је био претежно диспергован у цитоплазми на Т1 (А), али је његова акумулација примећена на међућелијским границама у наредним временским тачкама (Б-Е, стрелице).(ФЈ) β-катенин показује сличну акумулацију на међућелијским границама повезаних са АЈ комплексом.(А'-Е') СПЕЦЦ1Л и β-катенин показују преклапајуће бојење на ивицама ћелија при великој густини ћелија (стрелице).(Ф'-Ј') У СПЕЦЦ1Л-кд ћелијама, бојење β-катенином изгледа нормално при малој густини ћелија (Ф'-Х'), али се шири како се облик ћелије мења (И', Ј'; стрелице), што указује да АЈ су се промениле.Шипке = 10 µм.
Затим смо покушали да утврдимо ефекат недостатка СПЕЦЦ1Л на АЈ.Користили смо неколико маркера повезаних са АЈ, укључујући канонске компоненте Ф-актин, миозин ИИб, β-катенин и Е-кадхерин24,25,26,27.Актинска стресна влакна су се повећала у СПЕЦЦ1Л-кд ћелијама као што је претходно описано (Слика 3А, Б) 18 .Миозин ИИб повезан са актинским филаментима показао је сличан пораст у СПЕЦЦ1Л-кд ћелијама ин витро (Слика 3Ц, Д).АЈ-повезан β-катенин се везује за кадхерин на ћелијској мембрани, показујући нормалан образац експресије „саћа“ у контролним кубоцитима (слика 3Е,Г).Занимљиво, на равним сликама коришћењем конфокалне микроскопије, β-катенин (Слика 3Е, Ф) и Е-кадхерин (Слика 3Г, Х) бојење на ћелијској мембрани конфлуентних ћелија са СПЕЦЦ1Л-дефицијентом показало је истакнуте обрасце проширеног бојења.Ова експанзија бојења β-катенином повезаног са АЈ у кд ћелијама била је најизраженија на споју, али изгледа да претходи променама у облику ћелије (Слика 2Ф-Ј, Ф'-Ј').Да бисмо утврдили физичку природу овог проширеног АЈ бојења, испитали смо границе ћелија на апикално-базној површини СПЕЦЦ1Л-кд У2ОС ћелија трансмисијском електронском микроскопом (ТЕМ) (слика 3И, Ј).За разлику од контролних ћелија (слика 3И), које су имале одвојене регионе густе електроне који указују на АЈ (стрелице), кд ћелије (слика 3Ј) су показале велике, суседне регионе високе електронске густине што указује на АЈ дуж апикобазалне равни..Поред тога, на попречним пресецима, приметили смо обимне наборе ћелијске мембране у кд ћелијама (слика С1А, Б), што објашњава проширени образац трака за бојење β-катенина и Е-кадхерина (слика 3Ф, Х).У прилог улози СПЕЦЦ1Л у АЈс, β-катенин је ко-имунопреципитиран са СПЕЦЦ1Л у лизатима конфлуентних У2ОС ћелија (слика 3К).Заједно са продуженим имунолошким бојењем за АЈ маркере, ТЕМ анализа је била у складу са нашом хипотезом да недостатак СПЕЦЦ1Л повећава апикално-базалну густину и варијансу АЈ.
(АХ) Повећано бојење Ф-актина у кд ћелијама 48 сати након фузије (Т6; А, Б).Измењено бојење миозина ИИб повезаног са Ф-актином (Ц, Д).Глатки узорак бојења мембране β-катенина и Е-кадхерина у контролним ћелијама (Е, Г) је побољшан у СПЕЦЦ1Л-кд (Ф, Х) ћелијама.Шипке = 10 µм.(И–Ј) Електронске микрографије које посматрају апикално-базални међућелијски спој.Контролне ћелије показују различите регионе густе електронима који указују на лепљиве спојеве (И, стрелице).Насупрот томе, цео апикално-базални спој у СПЕЦЦ1Л-кд ћелијама изгледао је електронски густ (Ј, стрелице), што указује на повећану густину и дисперзију адхезивних спојева.(К) β-катенин је ко-имунопреципитиран са СПЕЦЦ1Л у конфлуентним У2ОС ћелијским лизатима.Слика преузета са једне тачке која представља један од четири независна експеримента.
Да бисмо разумели улогу СПЕЦЦ1Л у краниофацијалној морфогенези, креирали смо модел миша са недостатком Спецц1л користећи две независне ћелијске линије ЕС замке, ДТМ096 и РРХ048 (БаиГеномицс, ЦА), које представљају интрон 1, а Спецц1л транскрипти су снимљени на 115. (Слика 15). .4А, слика С2).Геномска локација уметка вектора мамаца одређена је секвенцирањем целог генома и потврђена ПЦР (слика С2).Оба дизајна замке гена су такође омогућила фузију у оквиру Спецц11-лацЗ репортера након хватања.Стога је експресија лацЗ одређена Кс-гал бојењем коришћена као индикатор експресије Спецц11.Оба алела су показала сличне обрасце експресије лацЗ, при чему је замка гена ДТМ096 у интрону 1 показала јачу експресију од РРХ048 у интрону 15 (није приказано).Међутим, Спецц1л је широко изражен, са посебно снажном експресијом у нервним наборима на Е8.5 (Слика 4Б), у нервној цеви и процесима лица на Е9.5 и Е10.5 (Слика 4Ц, Д), и у удовима у развоју на Е10.5 и очи (слика 4Д).Раније смо известили да је експресија СПЕЦЦ1Л у првом фарингеалном луку на Е10.5 била присутна у епителу и основном мезенхиму18, у складу са линијом ЦНЦЦ.Да бисмо тестирали експресију СПЕЦЦ1Л у ЦНЦЦ, урадили смо Е8.5 неуралне наборе (Слика 4Е-Ј) и Е9.5 секције лобање (Слика 4К-).На Е8.5, СПЕЦЦ1Л је интензивно обојен нервне наборе (Слика 4Е, Х), укључујући ћелије обојене НЦЦ маркерима (Слика 4Г, Ј).На Е9.5, СПЕЦЦ1Л (слика 4К, Н) снажно обојен мигрирајући ЦНЦЦ заједно са АП2А (слика 4Л, М) или СОКС10 (слика 4О, П).
(А) Шематски приказ гена Спецц11 миша који показује уметање вектора за мамце у ЕС ДТМ096 (интрон 1) и РРХ048 (интрон 15) ћелијске клонове.(БД) лацЗ бојење хетерозиготних Спецц1лДТМ096 ембриона који представљају Спецц1л експресију од Е8.5 до Е10.5.НЕ = неуроектодерм, НФ = неурални набор, ПА1 = први фарингеални лук.(ЕП) СПЕЦЦ1Л имунобојење са НЦЦ маркерима АП2А и СОКС10 у Е8.5 (НФ; ЕЈ) неуралним наборима и Е9.5 (КП) деловима лобање.СПЕЦЦ1Л бојење је широко примећено у нервним наборима Е8.5 (Е, Х; врхови стрелица), укључујући ћелије означене са АП2А (Ф, Г; врхови стрелица) и СОКС10 (И, Ј; врхови стрелица).На Е9.5, СПЕЦЦ1Л снажно обојени мигрирајући ЦНЦЦ (К, Н; стрелице) означени са АП2А (Л, М; стрелице) и СОКС10 (О, П; стрелице).
Укрштање хетерозиготних Спецц1лДТМ096/+ и Спецц1лРРХ048/+ мишева показује да два алела генске замке нису комплементарна и да су хетерозиготи једињења и ембрионални хомозиготи за било који алел генске замке ембрионално смртоносни (Табела С1).Менделски односи су указивали на смањење стопе преживљавања хетерозигота при рођењу (очекивано 1,34 наспрам 2,0).Приметили смо низак перинатални морталитет међу хетерозиготима, неки су имали краниофацијалне аномалије (слика С3).Међутим, ниска пенетрација ових перинаталних краниофацијалних фенотипова отежава проучавање њихових основних патофизиолошких механизама.Стога смо се фокусирали на ембрионални смртоносни фенотип хомозиготних Спецц11 мутаната.
Већина сложених хетерозиготних или хомозиготних Спецц1лДТМ096/РРХ048 мутантних ембриона није се развила након Е9.5–10.5 (слике 5А–Д), а неурална цев се није затворила напред (слике 5Б, Д) и понекад затворена позади (није приказано) ..Овај дефект затварања кранијалне неуралне цеви био је повезан са већином ДЛКС2 са ознаком ЦНЦЦ који је остао у нервним наборима на Е10.5, што указује да нема дисекције (Слика 5А'-Д').Да бисмо утврдили да ли је укупна величина ЦНЦЦ-а такође смањена, означили смо ЦНЦЦ линије са ГФП у нашим линијама за хватање гена са Внт1-Цре и РОСАмТмГ.Ми преносимо сортиране ГФП+ НЦЦ и ГФП- (РФП+) не-НЦЦ из целих ембриона.У Е9.5, удео ЦНЦЦ-ова обележених ГФП-ом се није значајно променио између ВТ и мутантних ембриона (није приказано), што указује на нормалну ЦНЦЦ спецификацију.Стога смо претпоставили да је заостало Внт1-Цре и ДЛКС2 бојење у изложеним неуралним наборима (Слика 5Б') последица дефектног ЦНЦЦ слојевитости, вероватно због повећане густине или дисперзије АЈ ћелија, као што се види у СПЕЦЦ1Л-кд ћелијама.Користили смо НЦЦ маркере СОКС10, АП2А и ДЛКС2 да потврдимо присуство ЦНЦЦ у неуралном набору (Слика 5Е-Р).На Е8.5, уочено је бојење неуронских набора за сва три НЦЦ маркера у деловима ВТ (Слика 5Е, Г, И) и Спецц1л мутанта (Слика 5Ф, Х, Ј).На Е9.5, док су НЦЦ маркери обојени мигрирајућим НЦЦ у ВТ пресецима (Слика 5М, О, К), уочено је резидуално НЦЦ бојење у изложеним неуралним наборима Спецц1л мутантних ембриона (Слика 5Н, П, Р).Пошто СОКС10 и ДЛКС2 означавају мигрирајуће ЦНЦЦ-ове, овај резултат сугерише да ЦНЦЦ-ови са недостатком СПЕЦЦ1Л постижу спецификацију након миграције, али не успевају да мигрирају из нервних набора.
Недостатак Спецц11 доводи до дефектног затварања неуралне цеви, деламинације ћелија кранијалног неуралног гребена и АЈ.
(А, Б') Е9.5 ВТ (А) Ембрион који носи мигрирајуће ћелије кранијалног неуралног гребена (ЦНЦЦ) обележене са Внт1-Цре (А').Насупрот томе, Спецц11 мутантни ембриони показују отворене неуралне наборе (Б), врхове стрелица) и ЦНЦЦ који нису мигрирали (Б', врхови стрелица).(Ц, Д') Слике светлог поља (Ц, Д') и имунобојење (Ц', Д') ЦНЦЦ маркера ДЛКС2 Е10.5 ВТ ембриона (Ц, Ц') и Спецц1л (Д, Д').У ВТ Е10.5 ембрионима, ДЛКС2-позитивни ЦНЦЦ колонизују шкржне лукове (Ц', стрелице), док код мутаната, упадљиво бојење опстаје у отвореним неуралним наборима (Д', стрелице) и у првим фарингеалним луковима (Д', стрелице).) са неким мрљама (стрелице) које указују на лошу деламинацију и миграцију ЦНЦЦ-а.ЕР) Секције ВТ и Спецц1л мутантних ембриона у фазама Е8.5 (Е–Л) и Е9.5 (М–Р) су означене НЦЦ маркерима СОКС10 (Е, Ф, М, Н), АП2А (Г, Х, О, П) и ДЛКС2 (И, Ј, К, Р).На Е8.5, НЦЦ бојење је примећено у дивљим неуралним наборима (НФ) и мутантним пресецима.Заједничко бојење СОКС10 и β-катенина у Е8.5 ВТ (К) и мутанту (Л) открило је повећано бојење β-катенина на границама ћелија у неуралним наборима.На Е9.5, примећено је бојење дивљег типа мигрирајућих ЦНЦЦ (М, О, К), док су код мутаната нестратификовани ЦНЦЦ обојени отворени неурални набори (Н, П, Р).(С–З) Анализа ин виво АЈ обележавања у короналним пресецима ембриона ВТ и Спецц11ДТМ096/РРХ048 са мутацијом Е9.5.У горњем десном углу је приказана приближна пресечна раван.У пресецима мутантних ткива примећено је појачано бојење Ф-актина (С, Т) и миозина ИИб (У, В).Слично ин витро резултатима на слици 3, код мутантних ембриона, примећено је појачано бојење мембране за β-катенин (В, Кс) и Е-кадхерин (И, З).(АА-ББ) Електронски микрограф пресека ембриона дивљег типа који гледа изван границе апикално-базалне ћелије показује јасан регион густе електрона који указује на адхезивне спојеве (АА, стрелице).Насупрот томе, у деловима Спецц11 мутантних ембриона (ББ, стрелице), цео апикобазални спој је густ електронима, што указује на повећану густину и дисперзију адхезивних спојева.
Да бисмо тестирали нашу хипотезу да је смањено слојевитост последица измењеног АЈ, испитали смо обележавање АЈ у изложеним неуралним наборима Спецц1л мутантних ембриона (сл. 5С-З).Приметили смо повећање актинских стресних влакана (слика 5С, Т) и пратећу повећану локализацију бојења миозином ИИБ на актинским влакнима (слика 5У, В).Важно је да смо приметили повећано бојење β-катенина (Слика 5В, Кс) и Е-кадхерина (Слика 5И, З) на међућелијским границама.Такође смо испитали β-катенин бојење НЦЦ у неуралним наборима Е8.5 ембриона (слика 5К, Л).Чинило се да је бојење β-катенином јаче у Спецц1л мутантним неуралним наборима (Слика 5Л и К), што сугерише да су АЈ промене почеле.На електронским микрографијама секција лобање Е9.5 ембриона, поново смо приметили повећано дифузно електронско-густо бојење у Спецц1л мутантним ембрионима у поређењу са ВТ (Слика 5АА, ББ и С1Е-Х).Узети заједно, ови резултати подржавају наше ин витро резултате у СПЕЦЦ1Л-кд У2ОС ћелијама и сугеришу да аберантно АЈ бојење претходи ЦНЦЦ стратификацији у нашим мутантним ембрионима.
С обзиром на познату антагонистичку везу између активности АКТ и стабилности Е-кадхерина, 17,28 претпоставили смо да је укључена ПИ3К-АКТ сигнализација.Поред тога, приметили смо субепидермалне мехуриће код неких од наших мутантних ембриона који су избегли смртност (<5%) на Е9.5-10.5 и уместо тога се сместили на око Е13.5 (слика С3).Субепидермалне везикуле су обележје смањене ПИ3К-АКТ сигнализације засноване на ПДГФРα12.Фантауззо и др.(2014) су известили да поремећај активације ПИ3К засноване на ПДГФРα у мутантним ембрионима ПдгфраПИ3К/ПИ3К доводи до субепидермалних везикула, дефекта неуралне цеви и фенотипова расцепа непца.Заиста, нивои пан-АКТ и активног фосфорилисаног Сер473-АКТ смањени су ин виво у Спецц1л мутантним ткивима до Е9.5 ембрионалног застоја (Слика 6А-Д).Смањење нивоа фосфорилисаног Сер473-АКТ може бити у потпуности последица смањења нивоа пан-АКТ ин виво (Слика 6Е) и ин витро (Слика 6Ф).Смањење ин витро је примећено само када су У2ОС ћелије биле снажно конфлуентне са променама у облику ћелије и густини АЈ (слика 6Д).Дакле, наши подаци сугеришу да је СПЕЦЦ1Л нови позитивни регулатор ПИ3К-АКТ сигнализације у краниофацијалној морфогенези.
(А–Е) Е8.5 (А,Б) и Е9.5 (Ц,Д) делови лобање или Е9.5 лизати из Спецц1л мутантних ембриона (Е) који показују нивое активног фосфорилисаног С473-АКТ и пан-АКТ редукције протеина , у поређењу са контролном ВТ.Вестерн блот је изведен на лизатима дивљег типа и мутантним лизатима под истим условима.Слике приказане за СПЕЦЦ1Л су узете из једне мрље.Иста мрља је уклоњена и поново испитана са анти-пан-АЦТ и β-актин антителима.Нивои Пан-АКТ у Е8.5 неуралним наборима (А, Б) и нивои фосфорилисаног С473-АКТ у Е9.5 пресецима лобање су значајно смањени.(Ф) Нивои Пан-АКТ су на сличан начин смањени у лизатима СПЕЦЦ1Л-кд У2ОС ћелија сакупљених при високој конфлуенци.Траке грешака представљају СЕМ из три независне Вестерн блот квантификације.(ГЈ) Секције ВТ ембриона на Е9.5 обојене са КИ67 и цепаном каспазом 3, респективно, показујући ћелијску пролиферацију (Г, Г') и малу апоптотичку активност (Х, Х').Спецц11 мутантни ембриони показују упоредиву пролиферацију ћелија (И), али је број ћелија које пролазе кроз апоптозу значајно повећан (Ј).
Затим смо испитали маркере пролиферације и апоптозе.Нисмо приметили никакву разлику у пролиферацији Е9.5 ембриона (Слика 6Е, Г у поређењу са И) са индексом пролиферације од 82,5% за ВТ мутанте и 86,5% за Спецц1л мутанте мерено КИ67 бојењем (п <0,56, Фисхер'с тачан тест).Слично томе, нисмо приметили никакву разлику у апоптози мереној бојењем за цепану каспазу 3 у нервним наборима на Е8.5 до заустављања ембриона (није приказано) (није приказано).Насупрот томе, апоптоза је значајно повећана код свих Е9.5 мутантних ембриона (Слика 6Ф, Х и Ј).Ово укупно повећање апоптозе је у складу са смањеном сигнализацијом ПИ3К-АКТ и раном ембрионалном смртношћу29,30,31.
Затим, да бисмо потврдили узрочну улогу за ПИ3К-АКТ сигнализацију у АЈ променама у нашим кд ћелијама, хемијски смо променили пут у контролним и кд ћелијама (Слика 7А-Ф).Користили смо као маркер фенотип промене облика ћелије примећен у конфлуентним СПЕЦЦ1Л-кд ћелијама, које смо квантификовали користећи однос најдуже димензије (дужине) и одговарајуће вертикалне димензије (ширине).Очекује се однос 1 за релативно округле или коцкасте ћелије (слика 7Г).Поред облика ћелије, такође смо потврдили ефекат на АЈ бојењем β-катенином (слика 7А'-Ф').Инхибиција ПИ3К-АКТ пута коришћењем вортманина била је довољна да промени облик ћелије у контролним ћелијама (Слика 7А, Ц) и АЈ (Слика 7А').ПИ3К-АКТ активатор СЦ-79 није утицао на облик ћелије (Слика 7А, Е) или АЈ експанзију (Слика 7А') у контролним ћелијама.У ћелијама СПЕЦЦ1Л-кд, даља супресија ПИ3К-АКТ пута је резултирала повећаном апоптозом (слика 7Б, Д) и израженим повећањем бојења β-катенином (слика 7Б'), што је у складу са нашим ин виво тешким мутантима.Важно је да је активација ПИ3К-АКТ пута значајно побољшала облик ћелије (Слика 7Б, Ф) и АЈ фенотипове (Слика 7Б”).Промене у облику ћелије су квантификоване као однос заокружености ћелија (ЦЦР) и упоређене за значајност као што је горе описано (Слика 7Г).Заиста, у контролним ћелијама (Слика 7Г, ЦЦР = 1,56), третман вортманином је био довољан да значајно промени облик ћелије (Слика 7Г, ЦЦР = 3,61, п < 2,4 × 10-9) до мере сличног уоченом у СПЕЦЦ1Л.-кд ћелије (слика 7Г, ЦЦР = 3,46).Третман вортманином ћелија СПЕЦЦ1Л-кд (слика 7Г, ЦЦР = 3,60, занемарљив) није био значајнији од нетретираних кд ћелија (слика 7Г, ЦЦР = 3,46, занемарљив) или контролних ћелија третираних вортманином (слика 7Г)., ЦЦР = 3,46, занемарљиво) додатно утиче на елонгацију ћелије (7Г, ЦЦР = 3,61, занемарљиво).Што је најважније, СЦ-79 АКТ активатор је обновио издужени фенотип СПЕЦЦ1Л-кд ћелија (слика 7Г, ЦЦР = 1,74, п < 6,2 × 10-12).Ови резултати потврђују да СПЕЦЦ1Л регулише ПИ3К-АКТ сигнализацију и сугеришу да умерено смањење СПЕЦЦ1Л утиче на ћелијску адхезију, док снажно смањење доводи до апоптозе (слика 8).
(А–Ф') Контролне (А, Ц, Е) и СПЕЦЦ1Л-кд (Б, Д, Ф) ћелије третиране инхибитором ПИ3К-АКТ пута вортманином (Ц, Д) или третманом активатором СЦ-79 (Е, Ф) .Нетретиране контролне ћелије су кубоидне (А) са нормалним β-мачјим ћелијским бојењем (А'), док су кд ћелије издужене (Б) са повећаним бојењем β-мачке (Б').Након супресије ПИ3К-АКТ пута, контролне ћелије су се издужиле (Ц) са експанзијом β-мачке (Ц'), док су кд ћелије почеле да се подвргавају апоптози (Д), слично нашим високо мутираним ембрионима и показују изузетно побољшану β-мачку.бојење (Д').Након активације ПИ3К-АКТ пута, контролне ћелије су остале коцкасте (Е) и имале су нормално β-мачка (Е') бојење, док су кд ћелије показале значајно побољшан облик ћелије (Ф) и β-мачку (Ф') бојење, што указује (Г) Степен промене облика ћелије у (АФ) је квантификован коришћењем односа заобљености ћелија (ЦЦР) најдуже димензије (дужине) и одговарајуће вертикалне димензије (ширине) коришћењем МетаМорпх софтвера.Нетретиране (НТ) СПЕЦЦ1Л-кд ћелије (ЦЦР = 3,46) биле су значајно дуже од контролних ћелија (ЦЦР = 1,56, п < 6,1 × 10–13).Вортова инхибиција ПИ3К-АКТ пута у контролним ћелијама била је довољна да изазове слично издуживање облика ћелије (ЦЦР=3,61, п<2,4×10-9).Слично, АКТ активација помоћу СЦ-79 у СПЕЦЦ1Л-кд ћелијама вратила је елонгацију ћелије на контролне нивое (ЦЦР = 1,74, п < 6,2 × 10–12).Третман вортманином ћелија СПЕЦЦ1Л-кд резултирао је повећаном апоптозом, али без даљег повећања промене облика ћелије (ЦЦР=3,60) у поређењу са нетретираним кд (ЦЦР=3,46, нс) или контролним ћелијама третираним вортманином (3,61) уоченим у .нс = није важно.Приказана су +/- СЕМ мерења за 50 ћелија.Статистичке разлике су израчунате коришћењем Студентовог т-теста.
(А) Шематски приказ инхибиције и активације ПИ3К-АКТ пута што доводи до АЈ промена и спасавања, респективно.(Б) Предложени модел стабилизације АКТ протеина помоћу СПЕЦЦ1Л.
Премиграцијски ЦНЦЦ захтевају АЈ лизу да се одвоје од неуроепителних ћелија предњег нервног набора1,15,32.Повећано бојење компоненти АЈ и губитак асиметричне дистрибуције апикално-базалне АЈ у ћелијама са недостатком СПЕЦЦ1Л и ин витро и ин виво, у комбинацији са физичком близином СПЕЦЦ1Л β-катенину, сугерише да СПЕЦЦ1Л функционише како би правилно одржао локалну стабилност АЈ за мишиће организације.актински цитоскелет.Повезаност СПЕЦЦ1Л са актинским цитоскелетом и β-катенином и повећањем броја кондензованих актинских филамената у одсуству СПЕЦЦ1Л је у складу са уоченим повећањем густине АЈ.Друга могућност је да повећан број актинских влакана у ћелијама са недостатком СПЕЦЦ1Л доводи до промене међућелијске напетости.Пошто ћелијски стрес утиче на динамику АЈ 33, промене напона могу довести до дифузнијег АЈ 34 .Дакле, све промене ће утицати на ЦНЦЦ слојеве.
Внт1 је изражен у раним нервним наборима који доводе до ћелија нервног гребена.Дакле, праћење лозе Внт1-цре означава и пре- и мигрирајући НЦЦ35.Међутим, Внт1 такође означава клонове дорзалног можданог ткива такође изведене из раних неуралних набора 35,36, што чини вероватним да наше бојење Е9.5 мутаната за Внт1 маркере у отвореним нервним наборима није ЦНЦЦ.Наше позитивно бојење за НЦЦ маркере АП2А и СОКС10 потврдило је да изложени неурални набори Спецц11 мутантних ембриона заиста садрже ЦНЦЦ.Поред тога, пошто су АП2А и СОКС10 маркери раног миграционог НЦЦ-а, позитивно бојење је показало да су ове ћелије постмиграционе ЦНЦЦ које се не могу стратификовати помоћу Е9.5.
Наши подаци сугеришу да је молекуларна регулација АЈ од стране СПЕЦЦ1Л посредована ПИ3К-АКТ сигнализацијом.АКТ сигнализација је смањена у ћелијама и ткивима са недостатком СПЕЦЦ1Л.Налази Фантауззо ет ал.подржавају директну улогу ПИ3К-АКТ сигнализације у краниофацијалној морфогенези.(2014) су показали да недостатак активације ПИ3К-АКТ сигнализације засноване на ПДГФРα доводи до фенотипа расцепа непца.Такође показујемо да је инхибиција ПИ3К-АКТ пута довољна да промени АЈ и облик ћелије у У2ОС ћелијама.У складу са нашим налазима, Цаин ет ал.37 показало је да смањење регулације ПИ3К α110 подјединице у ендотелним ћелијама доводи до сличног повећања перицелуларног бојења β-катенином, што се назива повећањем „индекса повезаности“.Међутим, у ендотелним ћелијама чији су актински филаменти већ високо организовани, супресија ПИ3К-АКТ пута доводи до лабавог облика ћелије.Насупрот томе, ћелије СПЕЦЦ1Л-кд У2ОС показале су издужени облик ћелије.Ова разлика може бити специфична за тип ћелије.Док супресија ПИ3К-АКТ сигнализације трајно утиче на актински цитоскелет, ефекат на облик ћелије је одређен променама у напетости изазваним променама у густини и организацији централних актинских влакана.У У2ОС ћелијама користили смо само промене облика ћелије као маркер промене и опоравка АЈ са недостатком СПЕЦЦ1Л.У закључку, претпостављамо да инхибиција АКТ пута у недостатку СПЕЦЦ1Л повећава стабилност АЈ и смањује деламинацију у ЦНЦЦ.
Занимљиво је да су нивои пан-АКТ смањени ин витро и ин виво поред фосфорилисаних нивоа 473-АКТ у одсуству СПЕЦЦ1Л, што сугерише регулацију ПИ3К-АКТ сигнализације на нивоу стабилности или промета АКТ протеина.СПЕЦЦ1Л и МИД1 гени, оба повезана са Опитз/ГБББ синдромом, кодирају протеине који стабилизују микротубуле 18,22.Механизам којим СПЕЦЦ1Л и МИД1 посредују стабилизацију микротубула није у потпуности схваћен.У случају СПЕЦЦ1Л, ова стабилизација укључује појачану ацетилацију подскупа микротубула 18 .Могуће је да СПЕЦЦ1Л користи сличан механизам за стабилизацију других протеина као што је АКТ.Показало се да ацетилација лизинских остатака у АКТ протеину доводи до смањења мембранске локализације и фосфорилације38.Поред тога, убиквитинација ланца К63 на истом остатку лизина на АКТ-у је потребна за његову локализацију и активацију на мембрани39,40.Међу неколико фактора који ступају у интеракцију са СПЕЦЦ1Л протеинима идентификованим у различитим високопропусним двохибридним екранима квасца, четири - ЦЦДЦ841, ЕЦМ2942, АПЦ и УБЕ2И43 - су умешани у промет или стабилност протеина путем убиквитинације или сумоилације.СПЕЦЦ1Л може бити укључен у посттранслациону модификацију АКТ лизинских остатака, утичући на стабилност АКТ.Међутим, критична улога СПЕЦЦ1Л у локализацији и стабилности АКТ протеина остаје да се разјасни.
Озбиљни дефекти експресије СПЕЦЦ1Л ин виво довели су до повећаног бојења АЈ маркера и дефектног прекривања ЦНЦЦ, као и до повећане апоптозе и ране ембрионалне леталности.Претходни извештаји су показали да су мутанти миша са повећаним нивоима апоптозе повезани са дефектима неуралне цеви 44,45,46,47 и краниофацијалним дефектима48.Претпоставља се да прекомерна смрт ћелија у неуралним наборима или фарингеалним луковима може довести до недовољног броја ћелија потребних за правилно морфогенетско кретање 48,49,50.Насупрот томе, наше ћелијске линије са недостатком СПЕЦЦ1Л са умерено смањеном експресијом СПЕЦЦ1Л показале су само промене АЈ без доказа повећане ћелијске смрти.Међутим, хемијска инхибиција ПИ3К-АКТ пута у овим Кд ћелијама је резултирала повећаном апоптозом.Дакле, умерено смањење експресије или функције СПЕЦЦ1Л обезбеђује опстанак ћелија.Ово је у складу са запажањем да ретки Спецц11 мутантни ембриони који избегну хапшење у ст.Е9.5 — можда због смањене ефикасности хватања гена — су у стању да затворе своје неуралне цеви и зауставе се касније у развоју, често са краниофацијалним дефектима (слика С3).Такође у складу са овим је ретка појава хетерозиготних Спецц1л ембриона са краниофацијалним абнормалностима - вероватно због повећане ефикасности хватања гена - као и налаз код зебрице у којој један од два СПЕЦЦ1Л ортолога (спецц1лб) узрокује касни ембрионални фенотип, укључујући губитак фенотипова. доње вилице и билатералне расцепе51.Дакле, хетерозиготне мутације губитка функције СПЕЦЦ1Л идентификоване код пацијената код људи могу изазвати мала оштећења функције СПЕЦЦ1Л током краниофацијалне морфогенезе, довољна да објасне њихове орофацијалне пукотине.Регулација међућелијских контаката заснована на СПЕЦЦ1Л такође може играти улогу у палатогенези и фузији фарингеалних лукова.Даља истраживања функције СПЕЦЦ1Л помоћи ће да се разјасни улога привремених међућелијских контаката у ЦНЦЦ-у током затварања неуралне цеви у покретљивости неуроепителијалне ћелије и краниофацијалној морфогенези.
Контрола остеосаркома У2ОС и ћелије СПЕЦЦ1Л-кд су претходно описане (Саади ет ал., 2011).Антитела против СПЕЦЦ1Л су такође раније окарактерисана (Саади ет ал., 2011).Анти-β-катенин антитела (зец; 1:1000; Санта Цруз, Даллас, ТКС) (миш; 1:1000; Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА), миозин ИИб (1:1000; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис). ) , МО) ), Е-кадхерин (1:1000; Абкам, Кембриџ, МА), АП2А (1:1000; Новус Биологицалс, Литтлетон, Колорадо), СОКС10 (1:1000; 1000; Авива Системс Биологи, Сан Дијего , Калифорнија), ДЛКС2 (1:1000; Абцам, Кембриџ, МА), пхоспхо-Сер473-АКТ (1:1000; Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА), пан-АКТ (1:1000; ТхермоФисхер Сциентифиц, Валтхам, МА ), КИ67 (1:1000; Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА), одцепљена каспаза 3 (1:1000; Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА) и β-актин (1:2500; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО ) је коришћен како је описано..Актински филаменти су обојени са Ацти-стаин родамин фалоидин (Цитоскелетон, Денвер, Цолорадо).
У2ОС контролне ћелије и СПЕЦЦ1Л-кд ћелије су култивисане у стандардном ДМЕМ са високим нивоом глукозе са додатком 10% феталног говеђег серума (Лифе Тецхнологиес, ​​Царлсбад, ЦА).За промене АЈ, 2 к 105 ћелија је засејано на стакло третирано са 0,1% свињског желатина (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) и посматрано за промене у облику ћелије.Ћелије су сакупљене у различитим назначеним временским тачкама: 4 сата након сејања (т = 1), 24 сата након сејања (т = 2), спајање без промене облика ћелије (т = 3), промена облика ћелије (т = 4) , 24 х након промене облика ћелије (т = 5) и 48 х након промене облика ћелије (т = 6) (сл. 1, 2, 3).Да би се модулирао ПИ3К-АКТ пут, ћелије су култивисане у назначеним концентрацијама са ПИ3К-АКТ инхибитором вортманином (ТОЦРИС Биосциенцес, Миннеаполис, Миннесота) или СЦ-79 активатором (ТОЦРИС Биосциенцес, Миннеаполис Адамс, Миннесота).Подлога која садржи хемикалије мењала се свакодневно.
Снимци оквир по кадар су направљени на живим контролним и КД ћелијама у нормалним условима културе, а слике фазног контраста су сакупљане сваких 10 минута током 7 дана.Слике су добијене коришћењем компјутерски контролисаног Леица ДМ ИРБ инвертованог микроскопа опремљеног механичким степеном и 10 × Н-ПЛАН објективом повезаним са КИмагинг Ретига-СРВ камером.Током снимања, ћелијске културе су одржаване на 37°Ц у влажној атмосфери са 5% ЦО2.
Две ћелијске линије ЕС за хватање гена ДТМ096 и РРХ048 из Регионалног центра за ресурсе мутантних мишева (УЦ Давис, ЦА) су коришћене за генерисање Спецц11 дефицитарних линија миша, означених као Спецц1лгтДТМ096 и Спецц1лгтРРХ046.Укратко, 129/РЕЈ ЕС ћелије су убризгане у Ц57БЛ6 бластоцисте.Добијени химерни мушки мишеви су узгајани са женкама Ц57БЛ6 мишева да би се идентификовало потомство са бојом длаке агоути.За идентификацију хетерозигота коришћено је присуство векторских уметака генске замке.Мишеви су држани на мешовитој позадини 129/РЕЈ; Ц57БЛ6.Локација места инсерције вектора генетске замке потврђена је РТ-ПЦР, секвенцирањем генома и генетском комплементацијом (додатна слика 1).Да би се пратила ЦНЦЦ линија двоструких хетерозиготних Спецц1лГТ мишева, РОСАмТмГ (# 007576) и Внт1-Цре (# 003829) мишеви (Јацксон Лаборатори, Бар Харбор, МЕ) су укрштени да би се произвео РОСАмТмГ и Внт1-Цре мутант у Спецц1лс.Сви експерименти на мишевима су изведени према протоколима које је одобрио Комитет за институционалну негу и употребу животиња Медицинског центра Универзитета у Канзасу.
Ембриони су фиксирани у (1% формалдехид, 0,2% глутаралдехид, 2 мМ МгЦл2, 0,02% НП-40, 5 мМ ЕГТА) током 60 минута на собној температури.Након фиксације у Кс-гал раствору за бојење (5 мМ калијум ферицијанида, 5 мМ калијум фероцијанида, 2 мМ МгЦл2, 0,01% натријум деоксихолата, 0,02% НП-40, 1 мг/мл Кс-гал) Развијање мрље је обављено на 37°Ц .°Ц у року од 1-6 сати.Ембриони су накнадно фиксирани у 4% ПФА и визуелизовани.
За Вестерн блоттинг, ћелије су лизиране у пуферу за пасивну лизу (Промега, Фитцхбург, ВИ) са додатком мешавине инхибитора ХАЛТ протеазе (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО).Лизати су обрађени на 12% полиакриламидним Мини-ПРОТЕАН ТГКС готовим геловима (Био-Рад, Херцулес, ЦА) и пребачени на Иммобилон ПВДФ мембране (ЕМД Миллипоре, Биллерица, МА).Мембране су блокиране у 5% млека у ПБС који садржи 0,1% Твеен.Антитела су инкубирана преко ноћи на 4°Ц или један сат на собној температури.За генерисање сигнала коришћен је Фемто СуперСигнал Вест ЕЦЛ реагенс (Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА).За имунолошко бојење, ембриони су фиксирани преко ноћи у 4% ПФА/ПБС и криоконзервирани.Криосекције ткива су блокиране у ПБС који садржи 1% нормалног козјег серума (Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА) и 0,1% Тритон Кс-100 (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО), а затим инкубирани на 4°Ц у инкубатору током ноћ.са анти-антителом и флуоресцентним секундарним антителом (1:1000) током 1 сата на 4°Ц.Обојени пресеци су стављени у ПроЛонг златни медијум (Тхермо Сциентифиц, Валтхам МА) и равне слике су добијене коришћењем Леица ТЦС СПЕ конфокалног микроскопа.Свако имунобојење је изведено као три независна експеримента на циросекцијама најмање два мутантна ембриона.Приказан је репрезентативни експеримент.
Ћелије су инкубиране у модификованом РИПА пуферу (20 мМ Трис-ХЦл, пХ 8,0, 1% НП-40, 130 мМ НаЦл, 10% глицерол, 2 мМ ЕДТА и инхибитор ХАЛТ протеазе (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) Укратко, лизати су претходно пречишћени магнетним перлама протеина Г (Лифе Тецхнологиес, ​​Царлсбад, Калифорнија) и затим инкубирани преко ноћи на 4°Ц са анти-СПЕЦЦ1Л или ИгГ протеинским Г протеинским перлама су коришћене за екстракцију СПЕЦЦ1Л и Вестерн блоттинг је изведен коришћењем анти -β-катенин антитело описано горе. Приказани ко-ИП експерименти су репрезентативни за четири независна експеримента.
Фиксне култивисане ћелије или ембрионална ткива миша су достављени центру за електронску микроскопију у Медицинском центру Универзитета у Канзасу.Укратко, узорци су уграђени у ЕМбед 812 смолу (Елецтрон Мицросцопи Сциенцес, Форт Васхингтон, ПА), полимеризовани преко ноћи на 60 ° Ц, и пресечени на 80 нм коришћењем Леица УЦ7 ултрамикротома опремљеног дијамантском оштрицом.Секције су визуелизоване коришћењем ЈЕОЛ ЈЕМ-1400 трансмисионог електронског микроскопа опремљеног 100 кВ Лаб6 пиштољем.
Како цитирати овај чланак: Вилсон, НР ет ал.Недостатак СПЕЦЦ1Л доводи до повећане стабилности спојених зглобова и смањеног деламинације ћелија неуралног гребена лобање.Наука.6, 17735;дои: 10.1038/среп17735 (2016).
Саинт-Јеанне, Ј.-П.Индукција и диференцијација нервног гребена.(Спрингер Сциенце + Бусинесс Медиа; Ландес Биосциенце/Еуреках.цом, 2006).
Цордеро, ДР ет ал.Ћелије кранијалног нервног гребена у покрету: њихова улога у краниофацијалном развоју.Амерички часопис за медицинску генетику.Део А 155А, 270–279, дои:10.1002/ајмг.а.33702 (2011).
Боланд, РП Неурокристопатија: њен раст и развој током 20 година.Педијатар.патологија.лабораторија.лек.17, № 1–25 (1997).
Манголд Е., Лудвиг КУ и Нотен ММ Пробој у генетици орофацијалних расцепа.Трендс ин Молецулар Медицине 17, 725–733, дои:10.1016/ј.молмед.2011.07.007 (2011).
Мину, М. и Рилеи, ФМ Молекуларни механизми миграције ћелија неуралног гребена и узорка током краниофацијалног развоја.Девелопмент 137, 2605–2621, дои: 10.1242/дев.040048 (2010).
Дикон, МЈ, Маразита, МЛ, Беати, ТХ и Мурраи, ЈК Расцеп усне и непца: разумевање генетских и еколошких утицаја.природан коментар.Генетицс 12, 167–178, дои: 10.1038/нрг2933 (2011).
Инграм, ЦР ет ал.Абнормална морфогенеза коже, удова и краниофацијалног региона код мишева са недостатком фактора 6 (Ирф6) који регулише интерферон.Натионал Генетте.38, 1335–1340, дои: 10.1038/нг1903 (2006).
Пеирард-Јанвид, М. ет ал.Доминантне мутације у ГРХЛ3 узрокују ван дер Вордов синдром и ометају развој оралног перидерма.Ам Ј Хум Генет 94, 23–32, дои: 10.1016/ј.ајхг.2013.11.009 (2014).
Харрис, МЈ и Јурилоф, ДМ Ажурирајте листу мутаната миша са дефектима у затварању неуралне цеви и напредујете ка потпуном генетском разумевању затварања неуралне цеви.Испитивање урођених мана.Део А, Клиничка и молекуларна тератологија 88, 653–669, дои: 10.1002/бдра.20676 (2010).
Фантауззо, КА & Сориано, П. ПИ3К посредована ПДГФРалпха сигнализација регулише преживљавање и пролиферацију у развоју скелета кроз п53-зависни интрацелуларни пут.Гене Девелопмент 28, 1005–1017, дои: 10.1101/гад.238709.114 (2014).
Копп, АЈ, Греен, НД и Мурдоцх, ЈН Дисхевелед: Однос конвергентне експанзије до затварања неуралне цеви.Трендови у неурологији.26, 453–455, дои: 10.1016/С0166-2236(03)00212-1 (2003).