310 10 * 1 мм Хемијска компонента спиралне цеви од нерђајућег челика, Н-терминални домени спидроина формирају хидрогелове на бази амилоидних фибрила и обезбеђују платформу за имобилизацију протеина.

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Клизачи који приказују три чланка по слајду.Користите дугмад назад и следећи да бисте се кретали кроз слајдове или дугмад контролора слајдова на крају да бисте се кретали кроз сваки слајд.

Спецификација

310 10*1мм Добављачи намотаних цеви од нерђајућег челика

Хемијски састав

Механичка својства

Рекомбинантни протеини паукове свиле (протеини паукове свиле) имају много потенцијалних примена у развоју нових биоматеријала, али њихова мултимодална природа и природа склона агрегацији чини их тешким за набавку и лаку употребу.Овде извештавамо да рекомбинантни минијатурни протеини спидроина и, што је важно, сам Н-терминални домен (НТ) брзо формирају самоносеће и провидне хидрогелове на 37 ° Ц.фузиони протеини који се састоје од НТ и зеленог флуоресцентног протеина или пурин нуклеозид фосфорилазе формирају потпуно функционалне фузионе протеине.Хидрогелови.Наши резултати показују да рекомбинантни НТ и фузиони протеини обезбеђују високе приносе експресије и дају хидрогеловима атрактивна својства као што су транспарентност, гелирање без умрежавања и директна имобилизација активних протеина при високој густини.
Пауци имају чак седам различитих скупова свилених жлезда, од којих свака производи одређену врсту свиле.Свих седам врста свиле се састоје од протеина паукове свиле (спидроина) дугих приближно 6000 остатака и садрже велики централни поновљени регион окружен сферичним Н- и Ц-терминалним доменима (НТ и ЦТ)1,2.Најшире проучавани тип свиле, примарна ампула, производи примарна ампула жлезда.У овој жлезди, монослој епителних ћелија синтетише протеине спидроина и излучује их у лумен жлезде, где су присутни у растворљивом облику (допинг) у изузетно високим концентрацијама (30–50% в/в)3,4.О организацији и конформацији главних ампуларних спидроинских протеина у жлезди се расправљало, али већина експерименталних доказа указује на присуство генерално спиралне и/или насумичне спиралне конформације и мицеларне или ламеларне структуре5,6,7,8,9,10.Док репетитивни домени регулишу механичка својства свилених влакана, формирајући нанокристале β-листова и аморфне структуре11,12,13,14,15, крајњи домени регулишу свилена влакна као одговор на променљиве услове дуж жлезде свиле16,17,18.Контролом формирања свиле, 19. Терминални домени су еволуцијски очувани и њихова функција може бити заједничка за све спидроин протеине 2,20,21.Током проласка кроз жлезду, пХ спидроина се смањује са око 7,6 на < 5,716 и расте са смицањем и растезањем посредованим кретањем кроз канал који се постепено сужава.У раствору, ЦТ је α-хеликални конститутивни паралелни димер17, али као одговор на ниску пХ вредност и силе смицања, ЦТ се одвија и мења β-слојеве16, 17, што може да покрене β-слојеве у репетитивним регионима Цонверт 16. НТ су мономерне под услови који одражавају услове у лумену жлезде и посредују у растворљивости спидроина, али при смањеном пХ, протонација већег броја бочних ланаца карбоксилне киселине доводи до димеризације НТ са пКа од приближно 6,5, чиме се стабилизује НТ и фиксира спидроин у великим количине.мреже16,18.Дакле, НТ игра кључну улогу у формирању филамента, мењајући се од мономера у премазу у димер у влакну23,24,25.НТ остаје високо растворљив и спиралан у свим до сада проучаваним условима16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, што је инспирисало његов развој као ознаке за повећање растворљивости за производњу хетерологних протеина.
Рекомбинантни мини пауков свилени протеин, који се састоји од једног НТ, једног кратког понављајућег региона, једног ЦТ и Хис6 ознаке (Хис-НТ2РепЦТ) за пречишћавање, растворљив је у воденом пуферу као и природни протеин свиле паука и опонаша природне важне карактеристике свиленог паука .покривеност 25.31.Хис-НТ2РепЦТ се може испредати у континуална влакна коришћењем биомиметичке машине у којој се премаз растворљив са пХ 8 екструдира у водено купатило пХ 525,32,33,34,35.Биореакторска ферментација Е. цоли која експримује Хис-НТ2РепЦТ и накнадни третман резултирали су приносом >14 г/Л након пречишћавања.Висок принос, висока растворљивост и адекватан одговор Хис-НТ2РепЦТ на киселе услове се приписују НТ23, 25, 34.
Овде извештавамо о брзом формирању провидних хидрогелова из рекомбинантних спидроин протеина, укључујући само НТ, инкубацијом протеинског раствора на 37 ° Ц.Користећи флуоресценцију тиофлавина Т (ТхТ), инфрацрвену спектроскопију Фуријеове трансформације (ФТИР), спектроскопију нуклеарне магнетне резонанце (НМР) и трансмисиону електронску микроскопију (ТЕМ), открили смо да НТ и микропаукови протеини пролазе кроз структурну трансформацију у β-лимове и фибриле сличне амилоиду. када се формирају гелови.Поред тога, фузиони протеини НТ и зеленог флуоресцентног протеина (ГФП) или пурин нуклеозид фосфорилазе (ПНП) ​​формирају хидрогелове са потпуно функционалним фузионим фрагментима.Експресија високе пропусности у хетерологним домаћинима, заједно са брзим формирањем хидрогела у физиолошким условима, отвара могућност исплативе производње хидрогелова са пројектованим функцијама.
За разлику од већине пријављених рекомбинантних спидроин протеина36, Хис-НТ2РепЦТ је стабилан у Трис-ХЦл пуферу на пХ 8 и може се концентрисати до 500 мг/мЛ без таложења25.Због тога смо били изненађени када смо открили да овај протеин брзо формира оптички чисте, самоносеће хидрогелове када се инкубира на 37°Ц (слика 1б-д).Даље студије су показале да се Хис-НТ2РепЦТ гелирање дешава у широком опсегу концентрација протеина (10–300 мг/мЛ) и да је ова концентрација у обрнутој корелацији са временом гелирања (слика 1ц и додатна слика 1).Да бисмо сазнали који делови Хис-НТ2РепЦТ посредују у формирању хидрогела, затим смо испитали сваки домен појединачно иу различитим комбинацијама користећи тест инверзије бочице (слика 1а,б).Све тестиране фракције рекомбинантног спидроина формирале су гелове (при концентрацији протеина од 300 мг/мЛ) за мање од 1 х, осим исталоженог 2Реп (слика 1б).Ово сугерише да НТ и ЦТ сами, у комбинацији, или повезани са понављањима, могу да гелирају на 37°Ц и да Хис6 ознака не утиче на овај процес у било којој значајној мери.Имајући у виду уобичајену идеју да је НТ високо растворљив и стабилан протеин, и да су претходни извештаји о рекомбинантним спидроин хидрогеловима приписали ефекте гелације конформационим променама у регионима који се понављају и/или ЦТ, сам НТ би могао.Откриће гелирања је било неочекивано.Додатна табела 1) 37, 38, 39. Занимљиво је да се НТ већ желирао у року од 10 минута при концентрацији од ≥ 300 мг/мЛ (слика 1ц).Експерименти инверзије бочица са различитим концентрацијама НТ показали су да је при >50 мг/мЛ раствор НТ желатио брже од Хис-НТ2РепЦТ при одговарајућој концентрацији (в/в, Слика 1ц).
Шематски приказ различитих спидроин конструката проучаваних у овом раду.б Време гелирања на 37 °Ц за различите рекомбинантне спидроин протеине (300 мг/мЛ) верификовано окретањем бочице.ЦТ гел одмах без инкубације (<300 мг/мЛ), 2Реп преципитата (300 мг/мЛ, скала 5 мм).ц Време гелирања Хис-НТ2РепЦТ и НТ при назначеним концентрацијама протеина на 37°Ц.д Фотографије Хис-НТ2РепЦТ и НТ хидрогелова са пауком и словом „НТ“ одштампаним испод, респективно (обе 200 мг/мЛ, скала бар 5 мм).
Хидрогелови формирани од различитих рекомбинантних протеина спидроина имају мало различите боје, а посматрање голим оком показује различите степене транспарентности (слика 1б).НТ гелови су изузетно бистри док други гелови постају непрозирни.Хис-НТ2РепЦТ и НТ гелови изливени у цилиндричне цеви могу се уклонити из калупа нетакнути (слика 1д).
Да би се тестирало да ли се природни премази од паукове свиле гелирају у условима за које је сада утврђено да изазивају гелирање рекомбинантних протеина спидроина, превлаке су сакупљене из велике ампулне жлезде шведског паука моста (Лариниоидес сцлопетариус).Облози су чувани у 20 мМ Трис-ХЦл пуферу при 50 мг/мЛ (на основу измерене суве тежине), али није примећено гелирање током 21-дневне инкубације на 37 ° Ц (додатна слика 2а).
За квантификацију ових гелова, реолошка мерења се могу користити за проучавање процеса гелирања и одређивање укупних механичких својстава.Посебно, праћење модула складиштења (еластичности) на повишеним температурама може пружити информације о температури желирања, као и вискоеластичним својствима премаза.Експерименти пораста температуре (користећи 1°Ц/мин на 25-45°Ц, на основу претходних студија коришћењем раствора природне свиле)40,41 показали су да се модули складиштења Хис-НТ2РепЦТ и НТ раствора повећавају са повећањем температуре.је повећан (слика 2 и допунска слика 3).Приметно је да је НТ модул почео да расте на нижој температури у поређењу са Хис-НТ2РепЦТ, у складу са бржим временом гела уоченог када је НТ директно инкубиран са Хис-НТ2РепЦТ на 37 ° Ц (Слика 1).Након накнадног пада температуре, модул складиштења се није вратио на ниже вредности и остао је изнад модула губитка (види додатну слику 3), што указује на термички иреверзибилну стабилну гелацију.Након гелирања, коначни модул еластичности се кретао од 15 до 330 кПа за Хис-НТ2РепЦТ хидрогелове у концентрацији од 100–500 мг/мЛ, а коначни модул еластичности за НТ хидрогелове (100–500 мг/мЛ) је био од 2 до 1400 кПа (слика 2 и комплетни подаци рампе) види додатну слику 3).
а Промена температуре током мерења Хис-НТ2РепЦТ (300 мг/мЛ) и б НТ (300 мг/мЛ) уз мућкање.Стрелице показују температурни тренд, а светлије сенчење података модула за складиштење приказује тестирање на нижим вредностима обртног момента за инструмент од оних које је навео произвођач, што је узрок повећане буке.ц Акумулација Хис-НТ2РепЦТ и НТ у крајњем модулу након повишене температуре (100, 300 и 500 мг/мЛ).Сва очитавања модула се узимају на фреквенцији од 0,1 Хз.
Као потенцијални метод за истраживање конформационих промена повезаних са гелацијом, снимили смо ФТИР спектре Хис-НТ2РепЦТ и НТ пре и после гелирања на 37 ° Ц (Слика 3а, б).Као што се и очекивало, спектри Хис-НТ2РепЦТ и НТ раствора су одговарали протеинима који показују секундарну структуру α-хеликса/насумичне завојнице, са израженом траком на 1645 цм-1.За оба хидрогела, гелирање је резултирало формирањем два крака у средњем И појасу на око 1617 цм-1 и 1695 цм-1 (Слика 3а, б), што указује на формирање антипаралелних структура β-лимова.Ове промене се такође могу јасно видети у одговарајућим спектрима гелирања другог деривата и разлике (додатна слика 4б).Две траке НТ β-слоја биле су израженије од оних код Хис-НТ2РепЦТ, што указује да је укупан садржај трака β-слоја у НТ хидрогелу био већи од оног у НТ2РепЦТ хидрогелу.
ФТИР апсорпциони спектри Хис-НТ2РепЦТ и б НТ (оба 500 мг/мЛ) пре (раствор) и после (гел) инкубације на 37°Ц.ц ТЕМ слике ресуспендованих 50 мг/мл НТ2РепЦТ гела и д НТ.Скала трака 200 нм.е Пречники влакана Хис-НТ2РепЦТ и НТ хидрогелова.н = 100 измерених фибрила, п < 0,0001.Траке грешака показују стандардну девијацију.Центар грешака је средња вредност.За статистичку анализу коришћен је неупарени т-тест (двострани).ф ТхТ флуоресценција различитих рекомбинантних спидроин протеина (100 мг/мЛ) на 37 °Ц без мућкања.г НТ (100 мг/мЛ) експерименти са инокулацијом од 100 мг/мЛ НТ гела са 0%, 5%, 10% и 20% семена.
Анализа гела применом трансмисионе електронске микроскопије (ТЕМ) показала је да се хидрогел састоји од фибрила сличних амилоиду (сл. 3ц, 3д).НТ-формиране фибриле су биле издужене (5–12 нм у пречнику) и неразгранате, док су Хис-НТ2РепЦТ фибриле биле краће по дужини и значајно ширег пречника (7–16 нм) (слика 3е).Ови резултати су нам омогућили да пратимо кинетику фиброзе користећи тиофлавин Т (ТхТ) тест.За све рекомбинантне спидроин протеине, флуоресцентни сигнал се повећао када су узорци инкубирани на 37 ° Ц (слика 3ф, додатна слика 5а).У складу са овим налазом, микроскопско испитивање НТ и Хис-НТ2РепЦТ у условима желирања открило је уједначено повећање флуоресценције ТхТ без приметне локалне акумулације ТхТ-позитивних агрегата (додатна слика 5б,ц).Формирање ТхТ-позитивних фибрила није било праћено повећањем замућености НТ и Хис-НТЦТ (допунска слика 5д), што значи да би се мрежа фибрила у гелу могла формирати без угрожавања чистоће гела.Сејање додавањем малих количина претходно формираних фибрила може значајно убрзати формирање фибрила неких амилоида42,43,44, али додавањем 5%, 10% или 20% (в/в) НТ у раствор НТ хидрокоагуланата.ефекат сејања (слика 3г).Можда је то због чињенице да су фибриле у хидрогелу релативно фиксиране и не могу се користити као семе.
Неочекивано понашање рекомбинантних спидроин протеина на високим температурама подстакло је даље студије спектроскопије нуклеарне магнетне резонанце (НМР) како би се идентификовале конформационе промене повезане са формирањем гела.НМР спектри раствора Хис-НТ2РепЦТ снимљени током времена на 37°Ц показали су да је ЦТ још увек делимично савијен, док су НТ и 2Реп сигнали нестали (слика 4а), што сугерише да су углавном НТ и 2Реп ти који делимично контролишу формирање Хис- НТ2РепЦТ хидрогел.ЦТ сигнал је такође ослабљен на 20% свог првобитног интензитета, што сугерише да је ЦТ такође углавном фиксиран и уграђен у структуру хидрогела.За мањи део ЦТ, који је мобилан као у претходно инкубираном узорку и на тај начин посматран НМР раствором, у спектрима недостају сигнали за првих 10 структурираних остатака, вероватно због тешке имобилизације причвршћеног дела Хис-НТ2Реп.НМР спектри -стања хидрогелова -НТ2РепЦТ открили су претежно присуство α-хеликса и β-слојева и, у мањој мери, случајну конформацију калема (слика 4б).Анализа хемијског померања остатака метионина присутних само у НТ показала је да је овај домен претворен у структуру β-листа.Временски зависни спектри НТ у раствору показали су уједначено смањење интензитета сигнала (слика 4ц), а НМР у чврстом стању НТ хидрогелова је показао да је већина НТ остатака претворена у структуре β-лимова (слика 4д).Конформација 2Реп није могла бити одвојено одређена због његове склоности агрегацији.Међутим, НМР спектри чврстог стања НТЦТ и Хис-НТ2РепЦТ хидрогела изгледали су веома слично (слика 4б; додатна слика 6б), што сугерише да је 2Реп мало допринео структурном делу Хис-НТ2РепЦТ хидрогела.За ЦТ хидрогелове, утврђено је да постоје α-хелике, β-лимови и насумичне спиралне секундарне структуре (додатна слика 6д).Ово сугерише да неки делови ЦТ остају α-хеликса док други постају β-листови.Дакле, резултати НМР спектроскопије сугеришу да је НТ важан за формирање хидрогела и да се такође трансформише у конформацију β-листа након фузије са 2Реп и ЦТ.У складу са овим, недавно смо открили да се амилоидни просторни затварачи вероватно формирају у свих пет спирала НТ домена, а Валцов алгоритам је предвидео амилоидогени регион у хеликсу 1 (слика 4е).
2Д спектри раствора 15Н-ХСКЦ 10 мг/мЛ Хис-НТ2РепЦТ пре (плаво) и 19 сати после инкубације (црвено) на 37°Ц.Појединачни укрштени врхови у црвеном спектру и Ф24, Г136, полиА у плавом спектру су означени једнословним симболима аминокиселина и бројевима остатака.Уметци показују зависност интензитета сигнала од времена за одабране остатке из НТ, 2Реп и ЦТ домена.б Радиофреквентни спектри чврстог стања (РФДР) Хис-НТ2РепЦТ хидрогелова.Корелације остатака Цα/Цβ уочене у РФДР спектрима одређене су поређењем са хемијским помацима модела пептида и вредностима изведеним из статистике82,83 и њиховим секундарним структурама.ССБ – ротирајући бочни појас.ц Једнодимензионални спектри раствора 15Н-ХСКЦ 10 мг/мЛ НТ током инкубације на 37 °Ц током 36 сати.Уметак показује запремински интензитет у односу на време.д РФДР спектри чврстог стања НТ хидрогелова.Приказане су корелације остатака Цα/Цβ и њихових секундарних структура уочене у РФДР спектрима.е Засновано на профилу склоности фибрилацији НТ45.79 из Зиппер базе података (хттпс://сервицес.мби.уцла.еду/зиппердб/).Розета енергија прозора просторног померања муње хексапептида приказана је у кцал/мол.Црвене траке означавају хексапептиде са високом склоношћу фибрози (Росетта енергија испод -23 кцал/мол; испод испрекидане линије).Зелене траке означавају фрагменте са Росетта енергијама изнад прага и стога је мање вероватно да ће формирати стеричне патентне затвараче.Фрагменти који садрже пролин су искључени из анализе (без колона).Квадрати означавају области амилоидозе предвиђене Валцовим алгоритмом81 (хттпс://валтз.свитцхлаб.орг).Секвенца аминокиселинских остатака НТ је на врху, а типови остатака који се налазе у β секундарној структури (утврђени НМР спектроскопијом у чврстом стању) су приказани црвеном бојом.Положаји пет НТ α-хеликса су означени као (Х1-Х5)28.
При пХ <6,5, ХТ димеризује, отпоран је на денатурацију изазвану топлотом или уреом18.Да би се разјаснило како димеризација и стабилност НТ утичу на гелирање, раствори који садрже 100 мг/мл НТ су контролисани на пХ 8, 7 и 6 коришћењем теста инверзије бочице.НТ узорци инкубирани на пХ 8 и 7 су гелирани након 30 минута на 37 °Ц, али је пХ 8 гел остао бистар, док је пХ 7 гел показао видљив талог (слика 5а).Насупрот томе, раствор који садржи ХТ на пХ 6 није формирао гел, а велики талог се могао видети након 20 минута на 37 ° Ц.Ово сугерише да сами димери и/или њихова већа стабилност у поређењу са мономерима спречавају гелирање.Формирање преципитата за НТ при пХ 7 и 6 није се очекивало, пошто је објављено да је НТ растворљив при 200 мг/мл27, лако се поново савија након топлотне денатурације, а такође задржава α-хеликс при нижим вредностима пХ 18. Вероватно објашњење за ове разлике је да су претходно пријављени експерименти изведени на собној температури или нижој, или при релативно ниским концентрацијама протеина16,18,19.
НТ тест инверзије бочице (100 мг/мЛ) на пХ 8, 7, 6 и 154 мМ НаЦл (пХ 8) после инкубације на 37°Ц.б НТ ЦД спектри са и без 154 мМ НаФ и 154 мМ НаЦл, респективно.Моларна елиптичност на 222 нм се претвара у пропорцију природних набора.ц НТ инверзиони тест (100 мг/мЛ) НТ* (37 °Ц и 60 °Ц), НТА72Р (37 °Ц) и Хис-НТ-Л6 (37 °Ц и 60 °Ц).д ЦД спектри НТ мутаната НТ*, НТА72Р и Хис-НТ-Л6.Моларна елиптичност на 222 нм се претвара у пропорцију природних набора.е Тест инверзије НТФлСп, НТМиСп и смањеног НТМиСп (100 мг/мЛ).Скала бар 5 мм.ф ЦД спектри НТ, НТФлСп, НТМиСп и редукованог НТМиСп.Моларна елиптичност на 222 нм се претвара у пропорцију природних набора.Пуни НТ спектри на 25 °Ц и 95 °Ц приказани су на додатној слици 8.
Физиолошка концентрација соли одређује електростатичке интеракције између НТ подјединица и димеризацију преноса НТ на нижи пХ18.Открили смо да присуство 154 мМ НаЦл и НаФ заиста инхибира гелацију, респективно (слика 5а, б; додатна слика 2б) и да су ове соли повећале термичку стабилност НТ мономера (слика 5б, додатна слика 8) .Такође сугерише да побољшање стабилности, а не димеризација, спречава стварање гела.
Да бисмо даље истражили улогу димеризације и стабилности протеина у гелирању, користили смо два мутанта, НТ* и НТА72Р, који такође остају мономерни при ниском пХ 28,30.НТ* је мутант двоструког наелектрисања у коме је привидна диполарна расподела наелектрисања мономера изравнана, што спречава димеризацију и драстично повећава стабилност мономера.НТА72Р је наелектрисани дипол, али Арг-супституисана Ала се налази на граници димера, тако да мутације ометају интеракције подјединица које су потребне за димеризацију.Након инкубације на 37°Ц, НТ* није формирао хидрогел, док је НТА72Р формирао непрозирни гел током 15 минута (слика 5ц).Пошто и НТ* и НТА72Р не могу да димеризују, али се разликују у стабилности мономера (слика 5д), ови резултати снажно сугеришу да висока термодинамичка стабилност спречава НТ од желирања.Ово је такође подржано чињеницом да ХТ* формира гел када је нестабилан на високој температури (после 8 минута на 60°Ц; слика 5ц).Раније је показано да висок садржај метионина у НТ течни његово природно савијање и да шест Мет то Леу замена (овде се помиње као Хис-НТ-Л6) снажно стабилизују НТ46 мономер.На основу претпоставке да је структурна флексибилност потребна за формирање НТ гела, открили смо да Хис-НТ-Л6 стабилни мутант није гелирао на 37 ° Ц (Слика 5ц, д).Међутим, Хис-НТ-Л6 је такође формирао гел након инкубације на 60°Ц током 60 минута (слика 5ц).
Способност НТ-а да се трансформише у структуре β-лимова и формира хидрогелове се може применити на неке, али не све НТ домене спидроина.НТ из различитих типова свиле и врста паука, Трицхонепхила цлавипес (НТФлСп), формирали су гелове упркос њиховом релативно ниском садржају метионина и високој термичкој стабилности (слика 5е, ф и додатна табела 2).Насупрот томе, НТ из малог ампуларног протеина спидроина из Аранеус вентрицосус (НТМиСп) са ниском термичком стабилношћу и високим садржајем метионина није формирао хидрогелове (додатна табела 2 и слика 5е, ф).Ово последње може бити повезано са присуством интрамолекуларних дисулфидних веза29,47.Доследно, када су дисулфидне везе НТМиСп смањене, формирао је хидрогел након инкубације на 37 ° Ц током 10 минута (слика 5е).У закључку, треба напоменути да је структурна флексибилност важан, али не и једини критеријум за формирање гела из НТ.Други фактор који може бити релевантан је склоност формирању амилоидних фибрила, а анализа са базом података са патент затварачем и Валц алгоритмом је показала корелацију између способности формирања гела и присуства амилоидогених региона, као и обима предвиђених региона. да се формирају стерички патентни затварачи.Постојала је корелација (додатна табела 2 и додатна слика 9).
Способност НТ да формира фибриле и формира гелове под повољним условима довела нас је до хипотезе да фузије НТ са другим протеинским фрагментима и даље могу да формирају гелове са пуном функцијом партнера фузије.Да бисмо ово тестирали, увели смо зелени флуоресцентни протеин (ГФП) и пурин нуклеозид фосфорилазу (ПНП) ​​на Ц-терминусу НТ, респективно.Добијени фузиони протеини су експримирани у Е. цоли са веома високим коначним приносима (150 мг/Л и 256 мг/Л мућкастих култура за Хис-НТ-ГФП и Хис-НТ-ПНП, респективно), у складу са оним што је показано за Други протеини фузионисани са НТ Реф.30. Хис-НТ-ГФП (300 мг/мЛ) и Хис-НТ-ПНП (100 мг/мЛ) фузиони протеини су формирали гелове након 2 сата и 6,5 сати на 37°Ц и, што је важно, ГФП фракција је остала непромењена.примећено након гелирања, са >70% почетног интензитета флуоресценције који је преостао након гелирања (слика 6а).Да бисмо измерили активност ПНП у растворима и геловима хис-НТ-ПНП, морали смо да разблажимо фузиони протеин са НТ јер је ензимска активност чистог препарата била изван опсега детекције теста при концентрацијама желирања.Гел формиран мешавином која садржи 0,01 мг/мЛ Хис-НТ-ПНП и 100 мг/мЛ НТ задржао је 65% почетне ензимске активности претходно инкубираних узорака (слика 6б).Гел је остао нетакнут током мерења (додатна слика 10).
а Релативни интензитет флуоресценције пре и после гелирања Хис-НТ-ГФП (300 мг/мЛ) и преокренуте бочице која садржи Хис-НТ-ГФП хидрогел (300 мг/мЛ) под видљивим и УВ светлом.Тачке показују појединачна мерења (н = 3), траке грешке показују стандардну девијацију.Просечна вредност је приказана у средини трака грешака.б ПНП активност је добијена флуорометријском анализом коришћењем раствора и гелова који се састоје од НТ (100 мг/мл) и смеше која садржи 0,01 мг/мл хис-НТ-ПНП и 100 мг/мл нових тајванских долара.Уметак приказује обрнуту бочицу која садржи хидрогел који садржи Хис-НТ-ПНП (5 мм скала бар).
Овде извештавамо о формирању хидрогелова из НТ и других рекомбинантних спидроин протеина инкубацијом протеинског раствора на 37 ° Ц (Слика 1).Показали смо да је гелирање повезано са трансформацијом α-хеликса у β-слојеве и формирањем фибрила сличних амилоиду (сл. 3 и 4).Овај налаз је изненађујући пошто су НТ намотани глобуларни снопови са пет спирала познати по својој изузетно високој растворљивости и високој стабилности при концентрацијама >200 мг/мЛ на 4°Ц током неколико дана27.Поред тога, НТ се лако поново савијају након топлотне денатурације при ниским концентрацијама протеина у µМ.Према нашим резултатима, формирање фибрила захтева комбинацију концентрације протеина >10 мг/мЛ и благо повишене температуре (слика 1).Ово је у складу са идејом да се амилоидна фибрила могу формирати од глобуларно пресавијених протеина који су у делимично несавијеном стању услед термичких флуктуација у физиолошким условима 48 .Примери протеина који се подвргавају овој конверзији укључују инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин и лизозим51,52,53.Иако је НТ α-хеликс у свом природном стању, приближно 65% полипептидног ланца је компатибилно са формирањем стеричног затварача (Слика 4е) 45 .Пошто је мономер динамички покретљив46, он може изложити ове потенцијалне амилоидогене регионе на умерено повишеним температурама и при високим концентрацијама укупног протеина може достићи критичну концентрацију за формирање амилоидних фибрила54.Пратећи ово резоновање, пронашли смо негативну корелацију између концентрације спидроина и времена гелирања (слика 1ц), и ако је мономерна НТ конформација стабилизована или мутацијама (НТ*, Хис-НТ-Л6) или додавањем соли, може спречити формирање хидрогелова (слика 5).
У већини случајева, амилоидни фибрили нестају из раствора као талог, али под одређеним условима могу да формирају хидрогелове55,56,57.Фибриле које формирају хидрогел обично имају висок однос ширине и висине и формирају стабилне тродимензионалне мреже кроз молекуларно преплитање,55,58 у складу са нашим резултатима.За формирање хидрогела ин витро, протеини се често потпуно или делимично одвијају, на пример, излагањем органским растварачима, високој температури (70–90°Ц) и/или ниском пХ (1,5–3,0)59,60,61,62.Спидроин хидрогелови који су овде описани не захтевају грубу обраду, нити захтевају агенсе за унакрсно повезивање да стабилизују хидрогелове.
Раније је објављено да понављања спидроина и КД, за које се чини да пролазе кроз пребацивање β-листова током предења свиле, формирају хидрогелове.У поређењу са нашим налазима, времена инкубације и/или температуре инкубације су биле знатно дуже или веће, а резултујући хидрогелови су често били непрозирни (слика 7 и додатна табела 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Поред брзих времена гелирања, НТ хидрогелови >300 мг/мЛ (30%) надмашили су све остале описане хидрогелове рекомбинантног протеина паукове свиле, као и природне хидрогелове као што су желатин, алгинат (2%), агар (0,5%) ) и колаген.(0,6%) (слика 7 и додатне табеле 1 и 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Време гелирања и модул еластичности хидрогелова у овој студији упоређени су са другим хидрогеловима на бази спидроина и одабраним природним хидрогеловима.Референце су дате заједно са описом услова гелирања.АПС Амонијум персулфат, собна температура.Подаци 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Чини се да су пауци развили начине да спрече желирање спидроина током складиштења.Упркос високој концентрацији протеина у жлезди свиле, велики поновљени регион повезан са терминалним доменом значи да привидна концентрација НТ и ЦТ у жлезди одговара приближно 10-20 мг/мл, на граници ове студије.потребно за ин витро уочено формирање хидрогела.Поред тога, сличне концентрације соли 16 стабилизовале су НТ, као у свиленим жлездама (слика 5б).Конформација НТ је проучавана у цитосолу Е. цоли и утврђено је да је чвршће савијена него када је испитивана ин витро, што даље указује да со или други фактори спречавају његову агрегацију ин виво.Међутим, способност НТ да се трансформишу у β-листове фибриле може бити важна за формирање филамента и требало би да се истражи у будућим студијама.
Поред нових аспеката формирања фибрила и хидрогела сличних НТ-амилоиду који су примећени у овој студији, такође показујемо да овај феномен може имати биотехнолошку и биомедицинску примену (слика 8).Као доказ концепта, комбиновали смо НТ са ГФП или ПНП и показали да фузиони протеин такође формира хидрогелове када се инкубира на 37 °Ц и да фракције ГФП и ПНП у великој мери задржавају своју активност након гелирања (слика 6).Нуклеозидне фосфорилазе су важни катализатори синтезе нуклеозидних аналога75, што наше откриће чини релевантним за биофармацеутску индустрију.Концепт експресије фузионих протеина који формирају транспарентне хидрогелове под повољним условима омогућава стварање функционализованих хидрогелова са повољним својствима за широк спектар примена као што су имобилизација ензима, контролисано ослобађање лека и инжењеринг ткива.Поред тога, НТ и НТ* су ефикасни маркери експресије30, што значи да се НТ и његове варијанте могу користити за производњу растворљивих фузионих протеина велике пропусности и накнадно стварање имобилизованих циљних протеина у 3Д хидрогеловима.
НТ је растворљив, α-хеликални и стабилан при ниским концентрацијама (µМ) и 37°Ц.На истој температури, али при растућим концентрацијама (>10 мг/мл), НТ формира гелове који се састоје од фибрила сличних амилоиду.НТ фузиони протеини такође формирају фибриларне гелове са потпуно функционалним фузионим фрагментима, омогућавајући различитим протеинима да буду имобилизовани у 3Д хидрогеловима користећи НТ.Доле: НТ (ПДБ: 4ФБС) и илустрације мрежа влакана и повезаних протеинских структура (претпостављено и није нацртано у размери, ГФП ПДБ: 2Б3К, 10.2210/пдб2Б3К/пдб; ПНП ПДБ: 4РЈ2, 10.2210/пдб4РЈ2).
Конструкти (видети додатну табелу 4 за комплетну листу укључујући секвенце аминокиселина) су клонирани у плазмид пТ7 и трансформисани у Е. цоли БЛ21 (ДЕ3).Е. цоли који садрже конструисане плазмиде инокулисане су у Луриа бујону са додатком канамицина (70 мг/л) и узгајане преко ноћи на 30°Ц и 250 рпм.Култура је затим инокулисана 1/100 у медијум ЛБ који садржи канамицин и култивисан на 30°Ц и 110 рпм док ОД600 није достигао 0,8.За НМР студије, бактерије су узгајане у М9 минималном медијуму који садржи 2 г Д-глукозе 13Ц (Алдрицх) и 1 г амонијум хлорида 15Н (Цамбридге Исотоп Лабораториес, Инц.) за обележавање протеина са изотопима.Смањите температуру на 20 степени Целзијуса и индукујте експресију протеина са 0,15 мМ изопропилтиогалактопиранозидом (коначна концентрација).После експресије протеина преко ноћи, ћелије су сакупљене на 7278 × г, 4 ° Ц током 20 минута.Ћелијске пелете су ресуспендоване у 20 мМ Трис-ХЦл, пХ 8, и замрзнуте до даље употребе.Одмрзнуте ћелије су лизиране коришћењем дисруптора ћелија (машине серије ТС, Цонстант Системс Лимитед, Енглеска) на 30 кПа.Затим су лизати центрифугирани на 25.000 г током 30 минута на 4°Ц.За НТМиСп, пелета је затим ресуспендована у 2 М урее, 20 мМ Трис-ХЦл, пХ 8, и соникирана 2 минута (2 с укључено/искључено, 65%), а затим поново центрифугирана на 25,000 кг, 4°Ц унутар 30 мин.Супернатант је стављен на Ни-НТА колону, испран са 20 мМ Трис-ХЦл, 2 мМ имидазола, пХ 8, и на крају је протеин елуиран са 20 мМ Трис-ХЦл, 200 мМ имидазола, пХ 8. Да би се створио НТ2РепЦТ и НТЦТ, варење тромбина уводи место (ТхрЦлеав) између Хис и НТ.Места цепања тромбина су такође присутна у Хис-НТ-ТхрЦлеав-2Реп (производи 2Реп), Хис-тиоредоксин-ТхрЦлеав-НТ (производи НТ), Хис-тиоредоксин-ТхрЦлеав-ЦТ (производи ЦТ), Хис-Тхиоредокин-ТхрЦлеав-НТ .* (производи НТ*), Хис-Тхиоредокин-ТхрЦлеав-НТА72Р (производи НТА72Р), Хис-Тхиоредокин-ТхрЦлеав-НТФлСп (производи НТФ1Сп) и Хис-Сулпхур Редокин-ТхрЦлеав-НТМиСп (производи НТМиСп).Конструкти су дигестирани тромбином (1:1000) и дијализовани преко ноћи на 4°Ц са 20 мМ Трис-ХЦл, пХ 8, коришћењем Спецтра/Пор дијализне мембране са прагом молекулске тежине од 6-8 кДа.После дијализе, раствор се ставља на Ни-НТА колону и сакупља се ефлуент који садржи протеин од интереса.Концентрације протеина су одређене мерењем УВ апсорбанције на 280 нм коришћењем коефицијента екстинкције сваког протеина, осим за НТФ1Сп, који је користио Брадфордов тест према протоколу произвођача.Чистоћа је одређена СДС полиакриламидном (4–20%) гел електрофорезом и Цоомассие бриљантно плавим бојењем.Протеини су концентровани коришћењем филтера за центрифугирање (ВиваСпин 20, ГЕ Хеалтхцаре) на 4000 кг са ограничењем молекулске тежине од 10 кДа у циклусима од 20 минута.
Одмрзните протеински раствор и пажљиво пипетирајте 150 µл у прозирну бочицу са преградом од 1 мл (8 к 40 мм Тхермо Сциентифиц).Епрувете су затворене и запечаћене парафилмом да би се спречило испаравање.Узорци (н = 3) су инкубирани на 37°Ц или 60°Ц и периодично инвертирани да би се посматрала гелација.Узорци који нису гелирали су инкубирани најмање недељу дана.Смањите НТМиСп дисулфидне везе са 10 мМ ДТТ по 10 µМ протеина.Да би се анализирало гелирање природних премаза од паукове свиле, шведски паук мост је исечен, две главне ампулисане жлезде су стављене у 200 μл 20 мМ Трис-ХЦл пуфера пХ 8 и исечене да би се омогућило да се премаз одвоји од жлезда..Садржај жлезда је растворен у пуферу, 50 µл за одређивање суве тежине (инкубацијом отворених бочица на 60 °Ц до константне тежине) и 150 µл за гелирање на 37 °Ц.
Мерна геометрија/алат је направљен од нерђајућег челика помоћу паралелне плоче са горњим пречником од 20 мм и размаком од 0,5 мм.Загрејати узорак од 25 °Ц до 45 °Ц и назад на 25 °Ц брзином од 1 °Ц у минути користећи Пелтиер плочу од нерђајућег челика.Вибрациона мерења су вршена на фреквенцији од 0,1 Хз иу линеарном вискоеластичном делу материјала при деформацији од 5% и 0,5% за узорке од 100 мг/мЛ и 300–500 мг/мЛ, респективно.Користите прилагођену комору за влажност да спречите испаравање.Подаци су анализирани помоћу Присм 9.
За сакупљање инфрацрвених (ИР) спектра на собној температури од 800 до 3900 цм–1.АТР уређај, као и пут светлости кроз спектрометар, пре и током експеримента се прочишћавају сувим филтрираним ваздухом.Раствори (500 мг/мЛ да би се минимизирали пикови апсорпције воде у спектрима) су пипетирани на кристале, а гелови (500 мг/мЛ) су формирани пре мерења и затим пребачени у кристале (н = 3).Снимљено је 1000 скенирања са резолуцијом од 2 цм-1 и нултим радним циклусом од 2. Други извод је израчунат коришћењем ОПУС-а (Брукер) коришћењем опсега изглађивања од девет тачака.Спектри су нормализовани на исти интеграциони регион између 1720 и 1580 цм-1 коришћењем Ф. Менгеса “Спецтрагрипх – Оптицал Спецтросцопи Софтваре”.У АТР-ИР спектроскопији, дубина продирања инфрацрвеног зрака у узорак зависи од таласног броја, што резултира јачом апсорпцијом на нижим таласним бројевима него на вишим таласним бројевима.Ови ефекти нису кориговани за спектре приказане на Сл.3 јер су веома мале (допунска слика 4).Кориговани спектри за ову цифру су израчунати коришћењем софтвера Брукер ОПУС.
У принципу, свеобухватна квантификација протеинских конформација је могућа након поуздане деконволуције компоненти унутар пика амида И.Међутим, у пракси се јављају неке препреке.Шум у спектру се може појавити као (лажни) врхови током деконволуције.Поред тога, врх услед савијања воде поклапа се са позицијом врха амида И и може имати сличну величину за узорке који садрже велику количину воде, као што је водени гел који се овде проучава.Стога, нисмо покушали да потпуно разградимо пик амида И, и наша запажања треба узети у обзир само у прилог другим методама као што је НМР спектроскопија.
Раствори од 50 мг/мл НТ и Хис-НТ2РепЦТ су гелирани преко ноћи на 37°Ц.Хидрогел је затим разблажен са 20 мМ Трис-ХЦл (пХ 8) до концентрације од 12,5 мг/мл, добро промућкан и пипетиран да би се гел разбио.Затим је хидрогел разблажен 10 пута са 20 мМ Трис-ХЦл (пХ 8), 5 μл узорка је нането на бакарну решетку обложену формваром, а вишак узорка је уклоњен папиром за упијање.Узорци су два пута испрани са 5 µл МиллиК воде и обојени са 1% уранил формата током 5 минута.Уклоните вишак мрље упијајућим папиром, а затим осушите мрежицу ​​на ваздуху.Снимање је изведено на овим мрежама коришћењем ФЕИ Тецнаи 12 Спирит БиоТВИН који ради на 100 кВ.Слике су снимљене при увећањима к 26.500 и к 43.000 помоћу Велета 2к × 2к ЦЦД камере (Олимпус Софт Имагинг Солутионс, ГмбХ, Минстер, Немачка).За сваки узорак (н = 1) снимљено је 10–15 слика.ИмагеЈ (хттпс://имагеј.них.гов/) је коришћен за анализу слике и мерење пречника влакана (н = 100, различита влакна).Призма 9 је коришћена за извођење непарних т-тестова (двострани).Просечна вредност Хис-НТ2РепЦТ и НТ фибрила износила је 11,43 (СД 2,035) и 7,67 (СД 1,389) нм, респективно.Интервал поверења (95%) је -4,246 до -3,275.степени слободе = 198, п < 0,0001.
80 µл течних узорака који садрже 10 µМ тиофлавина Т (ТхТ) мерено је у три примерка (н = 3) у статичким условима коришћењем Цорнинг плоча са провидним дном са 96 бунарчића (Цорнинг Гласс 3881, САД).Флуоресцентне разлике су забележене коришћењем ексцитационог филтера од 440 нм и емисионог филтера од 480 нм (ФЛУОСтар Галаки из БМГ Лабтецх, Оффенбург, Немачка).ТхТ сигнал није био ни засићен ни угашен, пошто су експерименти са различитим концентрацијама ТхТ изведени без промене интензитета сигнала.Забележите апсорбанцију на 360 нм за мерење магле.За експерименте са засејавањем, гелови од 100 мг/мЛ су формирани на 37°Ц, ресуспендовани и коришћени за засејавање у моларним односима од 5%, 10% и 20%.Подаци су анализирани помоћу Присм 9.
Одмрзните залихе Хис-НТ2РепЦТ и НТ >100 мг/мЛ на леду и филтрирајте кроз филтер од 0,22 µм.Концентрације су израчунате мерењем апсорбанције на 280 нм коришћењем Нанодроп-а.У бунарчићима црне плоче која се не везује (Цорнинг) са чистим дном, узорци су разблажени до 20 мг/мл у 20 мМ Трис-ХЦл пХ 8 и помешани са 5 μМ ТхТ (коначна концентрација), укупна концентрација узорка 50 μл запремине.Узорци су снимани сваких 10 минута на 37 °Ц на микроскопу ЦеллОбсервер (Зеисс) са каналом за пренос светлости и сетовима ФИТЦ ексцитације и емисионих филтера за ТхТ снимање.За снимање се користи сочиво 20к/0,4.За анализу слике коришћени су Зен Блуе (Зеисс) и ИмагеЈ (хттпс://имагеј.них.гов/).Гелови су такође припремљени од раствора НТ и Хис-НТ2РепЦТ у концентрацији од 50 мг/мЛ који садрже 20 мМ Трис пХ 8 и 5 µМ ТхТ и инкубирани на 37°Ц током 90 минута.Комади гела су пребачени у нови бунар који садржи 20 мМ Трис, пХ 8 и 5 μМ ТхТ у невезујућој црној плочи са 96 бунара.Набавите слике зелене флуоресценције и светлог поља при увећању од 20к/0,4.ИмагеЈ је коришћен за анализу слике.
НМР спектри раствора су добијени на 310 К на 600 МХз Брукер Аванце Нео спектрометру опремљеном са КЦИ Куадруполе Ресонанце Пулсед Градиент Фиелд Цриопробе (ХФЦН).НМР узорци који садрже 10 мг/мЛ хомогеног протеина обележеног са 13Ц, 15Н, раствореног у 20 мМ Трис-ХЦл (пХ 8), 0,02% (в/в) НаН3, 5% ДО (в/в), (н = 1) .Хемијски помаци НТ2РепЦТ на пХ 6,7 коришћени су за додељивање пика 23 у 2Д спектру 15Н-ХСКЦ.
Магични угаони НМР (МАС) спектри 13Ц, 15Н-обележених хидрогелова су снимљени на Брукер Аванце ИИИ ХД спектрометру на 800 МХз опремљеном са 3,2 мм 13Ц/15Н{1Х} сондом без електрона.Температура узорка је контролисана коришћењем струје гаса са променљивом температуром на 277 К. Дводимензионална диполна ротациона резонанција (ДАРР)76 и спектри радиофреквентне реконекције (РФДР)77 су добијени на МАС фреквенцијама од 12,5 кХз и 20 кХз, респективно.Унакрсна поларизација (ЦП) од 1Х до 13Ц је изведена коришћењем линеарне рампе од 60,0 до 48,0 кХз на 1Х, 61,3/71,6 кХз на 13Ц (на 12,5/20 кХз МАС) и контактног времена 0,5-1 мс.Током прикупљања података коришћено је раздвајање Спинал6478 на 73,5 кХз.Време аквизиције је било 10 милисекунди, а кашњење циклуса је било 2,5 секунде.Једно-повезане корелације Цα/Цβ уочене у РФДР спектрима додељене су на основу карактеристичних хемијских померања типа остатка и вишеструко повезаних корелација у ДАРР спектрима.
База података Зиппер79 (хттпс://сервицес.мби.уцла.еду/зиппердб/) је коришћена за процену тенденција треперења и Росетта енергије за НТ, НТФлСп и НТМиСп.База података Зиппер израчунава Росетта Енерги80, која комбинује неколико функција бесплатне енергије за моделирање и анализу структуре протеина.Енергетски ниво од -23 кцал/мол или нижи указује на високу склоност фибрилацији.Нижа енергија значи већу стабилност два β-ланца у конформацији патент затварача.Поред тога, Валтз алгоритам је коришћен за предвиђање амилоидогених региона у НТ, НТФлСп и НТМиСп Реф.81. (хттпс://валтз.свитцхлаб.орг/).
Раствор НТ протеина је помешан са пуфером 2-(Н-морфолино)етансулфонске киселине (МЕС) на пХ 5,5 и 6,0 да би се пХ снизио на пХ 6 и 7, респективно.Коначна концентрација протеина била је 100 мг/мл.
Мерења су вршена на Ј-1500 ЦД спектрометру (ЈАСЦО, САД) коришћењем кивете од 300 μЛ са оптичком путањом од 0,1 цм.Протеини су разблажени до 10 μМ (н = 1) у 20 мМ фосфатном пуферу (пХ 8).Да би се анализирала стабилност протеина у присуству соли, протеини су анализирани у истој концентрацији (н = 1) у 20 мМ фосфатном пуферу (пХ 8) који садржи 154 мМ НаФ или НаЦл, респективно.Скенирање температуре је забележено на 222 нм од 25°Ц до 95°Ц са брзином загревања од 1°Ц/мин.Пропорција природно савијених протеина је израчуната коришћењем формуле (КДмеасуре – КДфинал)/(КДстарт – КДфинал).Поред тога, снимљено је пет спектра за сваки узорак од 260 нм до 190 нм на 25°Ц и након загревања на 95°Ц.Пет спектра је усредњено, изглађено и конвертовано у моларну елиптичност.Подаци су анализирани помоћу Присм 9.
Интензитет флуоресценције Хис-НТ-ГФП (300 мг/мЛ, 80 µЛ) мерен је у три примерка (н = 3) у Цорнинг плочама са 96 бунарчића са црним провидним дном (Цорнинг Гласс 3881, УСА) у статичким условима.Измерите узорке читачем плоча на бази флуоресценције са таласном дужином ексцитације од 395 нм и забележите емисију на 509 нм пре гелирања и 2 сата касније на 37°Ц.Подаци су анализирани са Присм 9.
Комплет за испитивање активности пурин нуклеозид фосфорилазе (флуорометријска метода, Сигма Алдрицх) је коришћен према упутствима произвођача.За мерење активности у геловима и растворима који садрже Хис-НТ-ПНП, помешајте 10 нг Хис-НТ-ПНП са 100 мг/мЛ НТ до укупне запремине од 2 µЛ јер је гел давао сигнал изнад интервала детекције сета.Укључене су контроле за гелове и растворе без Хис-НТ-ПНП.Мерења су обављена два пута (н = 2).Након што је активност измерена, реакциона смеша је уклоњена и гел је фотографисан како би се осигурало да је гел остао нетакнут током мерења.Подаци су анализирани помоћу Присм 9.
За више информација о дизајну студије, погледајте сажетак студије природе повезан са овим чланком.
На сликама 1 и 2 приказани су почетни подаци.1ц, 2а–ц, 3а, б, е–г, 4, 5б, д, ф и 6, додатне слике.3, допунска сл.5а, д, допунска сл.6 и допунска сл.8. Подаци Подаци из ове студије налазе се у бази података Зенодо хттпс://дои.орг/10.5281/зенодо.6683653.НМР подаци добијени у овој студији објављени су у спремиште БМРБиг под ИД уноса бмрбиг36.Структуре ГФП и ПНП преузете су из ПДБ (ГФП 2Б3К, ПНП 4РЈ2).
Рисинг, А. и Јоханссон, Ј. Предење вештачке паукове свиле.Натионал Цхемицал.биологија.11, 309–315 (2015).
Бабб, ПЛ ет ал.Геном Непхила цлавипес наглашава разноликост гена паукове свиле и њихову сложену експресију.Натионал Генетте.49, 895–903 (2017).