347 ХЕМИЈСКА ЦОМПОНЕНТА ЗА СВЈЕТЛО И НЕКТРЕЊЕ СОБЉЕНЕ ЧЕЛИКЕ КОМПОНАЦИЈЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЈА НОВОГ ИНТЕРФЕРОН-РАСПРОДАЊА ФУРАНИХ ЛЕУКОЦИТЕ АНГИГЕН-а (ХЛА-А) ЦХАПЕРОНЕ протеини коришћењем умрежене масене спектрометријске масе (ЦЛМС)

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Клизачи који приказују три чланка по слајду.Користите дугмад назад и следећи да бисте се кретали кроз слајдове или дугмад контролора слајдова на крају да бисте се кретали кроз сваки слајд.

Опис производа

Цеви од нерђајућег челика 347Л, класа челика: СС347Л

Сигурносни систем интерферона изазива снажан цитокински одговор на широк спектар патогених и унутрашњих патолошких сигнала из окружења, што је резултирало индукцијом подскупова интерферонских протеина који су индуцибилни интерферон.Применили смо ДСС посредовану масу масене масе (ЦЛМС) за откривање нових интеракција протеинских протеина у домену протеина индукованих интерфероном.Поред очекиваних интерферонских протеина, идентификовали смо и нове интермолекуларне и интрамолекуларне унакрсне адукције канонских интерферонских протеина који су индуцибилни интерферон као што су МКС1, УСП18, ОАС3 и Стат1.Фокусирали смо се на ортогоналну валидацију новог скупа интерферонских индуктибилних протеинских мрежа које је формирало ХЛА-А протеини (Х2БФС-ХЛА-А-ХМГА1) користећи ко-имунопреципирање и њихово даљње проучавање користећи моделирање молекуларне динамике.Моделирање конформационе динамике протеинских комплекса открило је неколико локација интеракције које су одражавале интеракције идентификоване у ЦЛМС налазима.Заједно представљамо пилот студију ЦЛМ-ова за идентификацију нових сигналних комплекса индукованих интерфероном и веселимо се широј употреби ЦЛМ-а да идентификују нову динамику протеинских интеракција у микројекту.
Пре него што започне адаптивни имунолошки одговор, урођени одбрамбени систем домаћина поставља антимикробни одговор посредовао породицом излучених алфа-спиралних цитокина који се називају интерферони (ИФНС).ИФН класе типа ИФНа и ИФНβ активираћеће ћелијске одговоре, укључујући антивирусне, пропоптотске, проинфламаторне и антипролиферативне државе.Код људи је познато 13 подтипова ИФНа-а, све кластерирано на хромозому 91. Изненађујуће, само ИФНα2 је проучаван за клиничку употребу.Недавно је посебна пажња посвећена истраживању других подтипова ИФНа.Недавна студија је показала да је ИФНа14 једна од најефикаснијих изоформи у ограничењу ХБВ2 и ХИВ-13,4 репликације у поређењу са цанонским подтипом ИФНα2.
Утврђено је да активирани тип И интерферонски комплекси типа И интерферон (ИФНАР1 и ИФНАР2) покрећу каскаду трансдукције сигнала посредоване Јанусом киназе Тик2 и Јак15,6.Ове јанус киназе фосфорилате претварачи сигнала и транскрипцијски протеин активатори (Стат1 и Стат2) на остацима тирозина за иницирање ХЕТЕРОДИМЕРИЗЕРИЗЕРИЗЕРИЗЕРИЗЕРИЗЕРИЗАЦИЈЕ СХ2.Након тога, ИРФ9 везује Стат Хетерородимерс да формирају триерни комплекс Генског гена стимулисаног фактора ИФН-а, који се превози у језгро и индукује транскрипцију преко 2000-оних гена који су стимулисали на 2000 интерферона (ИСГС) 5,6,7,8.
ИСГС представља окосницу урођеног имунолошког система, посебно као одговор на вирусни напад.Као прва линија одбране од вирусне инфекције, ћелије се брзо распоређују опсежне интеракције ћелијских протеина са широким спектром биолошких активности.Научна подршка 15, 16.
Основни биолошки процес који је укључен у сузбијање инфекције и малигне трансформације је антиген презентација, које је посредовао великим комплексом хистокомпатибилности (МХЦ).Т ћелије препознају и уништавају ове патогене и ћелије које носе антиген специфичан за тумор.Сходно томе, патогени и туморске ћелије често сузбијају процес презентације антигена како би се избегло имунолошко надгледање.Поред тога, МХЦ-И срушава се у 40-90% људских тумора и често је повезан са сиромашним прогнозом19.
Гени који су укључени у одговор на патогене морају се брзо пребацити између стања одмора и стања активног транскрипта.Стога је неколико ћелијских протеина хипотезирано да се укључи у одговор на висок ИФН потражња током кратких периода, укључујући преуређивање и модификацију промотора Цхроматин 20,21.Већина студија се фокусирала на идентификацију појединих партнера ИСГ протеина у присуству ИФН-а.Неколико протеомичних и транскриптских студија у моделним ћелијским системима разјаснило је ефекат ИФН-а на ћелијски пејзаж.Међутим, упркос растућем разумевању динамике индуковане интерферонима, још увек знамо мало о укључивању ИСГС-а.
Да бисмо се бавили овим питањима, реализовали смо дискуктимид који је без суберате посредованог хемијско повезивање (ДСС) заједно са масовном спектрометријом (ЦЛМС) за проучавање мреже протеинских интеракција и ИФНа-а и њену динамику.ДСС додаје ковалентне везе између проксималних остатака протеина и / или протеинских комплекса ин виво.Накнадна МС Анализа открива специфичне прекршајне ​​локације које одражавају просторна близина региона у одређеном протеину, које се називају унутрашњим везама или подјединицама у протеинским комплексима, названим међусобним трошковима.Помоћу овог приступа идентификовали смо неколико нових комплекса протеинских протеина и интерферон-индукованих интеракцијских мрежа интеракције.Даљњем тестирањем подскуп ових нових интеракција, демонстрирамо да Х2БФС (Х2Б хистон типа ФС; у даљем тексту: у даљем тексту Х2Б) и МДН1 делују као обавезујуће партнере за ХЛА-а.
Фло-1 ћелије су једна од најпознатијих у витро моделима једњакашког аденокарцинома док опонашају кључне карактеристике сукозаних тумора22,23.Међутим, нису сви тумори имуногени и да одреде да ли ћелије Фло-1 реагују на третман интерферона, третирали смо Фло-1 ћелије са 10 нг / мл ИФНА 72 сата.Фло-1 ћелије показале су рану индукцију ПСТАТ1 и ИРФ1, почевши од 2 сата након третмана и настављају се 72 сата, са временским смањењем стационарних нивоа ИРФ1 (Слика 1а).Откривено је да је ИСГС (МКС1, ИФИТМ1, ОАС1 / 2 и ИСГ15) снажно изазван након 6 сати, опонашајући класичне одговоре на средини и касне фазе на ИФНа (Слика 1а).Ови подаци сугерирају да се овај ћелијски модел може користити за проучавање интерферонских одговора.
Различити одговори експресије протеина у ћелијама Фло-1 након лечења ИФНА.(А) експресија протеина у ћелијама Фло-1 третирана са 10 нг / мЛ ИФН-а за 2, 6, 24, 48 и 72 сата анализирала је имуноблот користећи назначене ИСГ антителове.(Б) ЦООМАСАСИЕ БЛУЕ ГЕЛС СДС-СТРАНИЦЕ Гелови целог ћелијског екстракта Након унакрсног повезивања са ДСС-ом за назначено време и концентрације.(Ц) Репрезентативни имуноблот прегледао је антитело П53 (ДО-1) из истих узорака за процену степена међусобне везе протеина.
To determine the optimal DSS concentration and avoid over-crosslinking, we first exposed the cells to 5, 2.5, and 1 mM DSS for 5, 10, 5, and 30 minutes, respectively, and analyzed the lysates by Coomassie-stained SDS-PAGE (подаци нису приказани).Чини се да су ћелијски лизати високо укрштени у најнижој концентрацији и у најкраћем тренутку.Стога је ДСС био титриран на 1, 0,5 и 0,1 мм током 5 минута (слика 1б).Оптимални умрежавање је примећено са 0,5 мм ДСС-ом 5 минута, а ови услови су изабрани за ћелије третиране ИФН-ом.Поред тога, Слика 1Ц приказује западни блот који се изводи помоћу антитела П53 (ДО-1) да би се проценио степен међусобног повезивача протеина.
Фло-1 ћелије су третиране са 10 нг / мл ИФНа 24 сата пре додавања крижања.Покривене ћелије су потом биле лизиране протеолизом два корака и протеини су обрађени ФАСП (Сл. 2) 24,25.Укрштени триптични пептиди су анализирани масеним спектрометријом (Сл. 2).МС / МС Спецтра се затим подударају са секвенцом протеина и квантификоване са МакКуант26,27.Покривени пептиди су идентификовани од добијених спектра помоћу СИМ-КСЛ програма, а појединачна једињења су комбинована у сложену мрежу користећи КСКУЕСТ28 и СИМ-КСЛ29 Рачунарски софтверски цевовод (слика 2).Сим-КСЛ идентификује интеракције протеина-протеина, интерне ланце и појединачне ланце у једноставним или сложеним протеинским смешама и пружа скрипте за визуелно интеракције у протеинским структурама.Поред тога, она се сврстава на сваку унакрсну референцу као ИД ид према МС / МС29 квалитету спектра.Идентификовано је неколико високо поузданих интеракција протеинских протеина и комплекса, а нови скуп интеракција је даље испитиван коришћењем ко-имунопреципитације и конформационих промена комплекса користећи моделирање молекуларне динамике (МД) 30, 31.
Схематски преглед ЦЛМС методе.Филтрирајте ниске интеракције поверења на основу лажних резултата позитивних стопа (ФДР).
Откривено је укупно ~ 30.500 и ~ 28.500 пептида који је откривен максималношћу у нестимулираним и стимулисаним узимањем ИФНА-е, респективно (додатна табела С1, Сл. 3а).Дистрибуција дужине пептида у оба случаја показала је већи удео већих пептида, што указује на присуство умрежених пептида (Сл. 3б, Ц).Поред тога, већи део већих пептида присуствовало је 40-55 распона у узорацима који се обрађује ИФНа (Сл. 3Ц).Мапирање протеина против интензитета Лог2 показало је да су класични протеини који стимулисали интерферон најобичнији у поређењу са необрађеним узорцима, укључујући МКС1, ИФИТ1 / 3, ОАС2 / 3, ДДКС58 и ХЛА-Ф (Слика 3Д).Анализа путева за протеине више од троструко обогаћених као одговор на лечење ИФНА-а користећи базу података РеацтАцт АцтАцт-а, показала је да је МХЦ-И-посредовани антиген презентација и предовлађивање била најдоминантнија пута (слика 3Е).У складу са ранијим извештајима, антивирусни одговори посредоване ОАС и ИСГ15, као и ИФНа / β и цитокински сигнализација били су међу активираним стазама.Поред тога, прекривени су прекривени линкс специфични за лизин и серине са првобитно стеченим МС / МС Спектрима користећи Сим-КСЛ.Недавна студија је пријавила 104 ИСГС-а који се протеже 20 вируса са 9 часова вируса од стране мета-анализе појединих студија оверсекције ИСГ-а у 5 ћелијских врста9.Међутим, за превазилажење рачунарских ограничења величине великих скупова, започели смо са мањим подацима да истражујемо могуће интеракције између листе ИРДС гена које је објавио Падариа ет ал., Који је већина ИСГС.
Идентификација различитих изражених унакрсних протеина као одговор на ИФНα (подаци добијени од Маккуант).(А) Венн Диаграм који представља број уобичајених и ексклузивних пептида идентификованих у ИФНа14 третираним и необрађеним узорцима Фло-1.Дужина пептидне дужине необрађене (б) и ИФНа третиране (ц) умрежене узорке.(Д) Мапа топлоте која представља лог2 (ЛФК интензитет) између необрађених и ИФНа14 третираних фло-1 ћелија.Лева панел показује да су протеини који су се највише активирали у присуству ИФНа.(Е) Хистограм који представља 20 главних путева обогаћивања након лечења ИФНА.База података о реакцијској стази анализирала је више од четири програма промјене у регулисаним протеинима који реагују ИФНα.
Стимулација ИСГ-а посредоване интерфероном добро је документована, али на молекуларном нивоу је слабо разумена како ови протеини кулминирају у широком распону биолошких функција.Истражили смо интеракције протеина са високим степеном поверења између познатих ИСГС-а.Занимљиво је да смо идентификовали мрежу укључујући МКС1, УСП18, РОБО1, ОАС3 и Стат1 протеине који чине велики комплекс као одговор на лечење ИФНа (Слика 4, Табела С2) 32,33,34.Оно што је најважније, ове интеракције су пронађене у свим троструким третираним ИФН-у и нису пронађене у необрађеним узорцима, што сугеришу да су формиране посебно као одговор на лечење ИФНа.Познато је да Стат1 транскрипционално регулише израз ових ИСГС-а, али његова интеракција са ИСГС-ом на нивоу протеина није проучена.Кристална структура Стат1 показала је да његов спирални домен (ЦЦД) није укључен у интеракцију са ДНК или протомирима током формирања Димер35.Ове хеликове ће формирати спиралну структуру хеликовања која пружа претежно хидрофилну површину за интеракције да се појаве 35.У нашим ЦЛМС података, приметили смо да је већина интеракција са Стат1 дошло у домену СХ2 која је претходила ЦЦД-у, Линкер домену или Ц-терминалном репу (остаци 700-708) (Слика 4а).Претходна студија је известила да УСП18 везује до домене ЦЦД и ДНК-везујућа (ДБД) Стат2 и регрутује се на подјединицу типа И интерферон рецептора ИФНАР2 у посредовање инхибиције типа И интерферон.Наши подаци су такође показали да УСП18 каталитички домен интеракција са Стат1 ДБД (Слика 4а, Д), сугерирајући да и стат1 и Стат2 могу да играју улогу у привлачењу УСП18 у ИФНАР2.
Мрежа протеина протеина ИСГ идентификована у унакрсним ћелијама третираним ИФН-ом.(А) 2Д заплет интеракције који приказује интеракције протеина протеина (генерисано у програму СИМ-КСЛ), са линијама које представљају интерколекуларне интеракције (ЦроссЛинк Цусефф је постављен на 3.5).Домене различитих идентитета обележени су њиховим боја32: МКС1 домен, динамин_н (73-249), динамин_м (259-547) и ГЕД (569-660).ОАС3 Домаинс: ОАС1_Ц (160-344), ОАС1_Ц (559-745), НТП_ТРАНСФ_2 (780-872) и ОАС1_Ц (903-108).Домаин РОБО1, ИГ_3 (67-151), И-сет (170-258), И-сет (262-347), ИГ_3 (350-432), ИГ_3 (454-529), ФН3 (562-646), ФН3 (678-758) и ФН3 (777-864).Стате1 поља: стат_инт (2-120), стат_алпха (143-309), стат_бинд (321-458), СХ2 (573-657) и стат1_таз2бинд (715-739).(Б) кружни гледалац унакрсних протеина (МКС1, УБП18, ОАС3, РОБО1 и СТАТ1) са интеракцијама и интеракцијама означеним плавим и црвеним, респективно.Претпостављени праг је постављен на 3.5.Дот парцеле означавају странице интеракције Стат1 са МКС1 (Ц), УСП18 (Д), РОБО1 (Е) и ОАС3 (Ф), као и К или С локацијама за интеракцију између два пептида.На слици је праг унакрсног линка постављен на 3.0.(Г) разне сајтове интеракције између Стат1 и ОАС3 ДИ домена су поднеле своје протеинске структуре у Пимолу (Пимол Молекулар Графички систем, верзија 2.0 Сцхродингер, ЛЛЦ.);СТАТ1 (ПДБ ИД: 1БФ533) и ОАС3 (ПДБ ИД: 4С3Н34).) програм.
Две изоформе УСП18 описане су код људи, протеина у целој дужини који се претежно налази у језгру и изоформи без Н-терминалног домена, УСП18-СФ, који је равномерно распоређен у цитоплазми и језграма 36.Поред тога, предвиђа се да Н-Терминус неструктурира и не захтева активност изопептидаза или везивање ИСГ1537.Већина интеракција идентификованих у нашој студији налазила се на Н-крају протеина, сугерише да ове интеракције укључују УСП18 (слика 4а, д) и на тај начин се вероватно појављују у језгру.Штавише, наши подаци такође указују на то да је Н-крај специјализован за интеракције протеина до протеина.Везивање у ИФНАР2 налази се између остатака 312-368, а посебно, ниједан од протеина у комплексу везан за овај регион (Сл. 4а) 37,38.Ови подаци узети заједно указују на то да домен везујућа ИФНАР2 искључиво користи протеин рецептора.Поред тога, утврђено је да су само ОАС3 и РОБО1 повезани са доменима узводно од локације везивања Н-Терминус и ИФНАР2 (Слика 4а).
Робо1 припада имуноглобулину (ИГ) СуперФамили оф ТрансмемБране сигналне молекуле и састоји се од пет ИГ домена и три фибронектин (ФН) домена у ванћелијској регији.Ове екстраћелијске домене прате мембранско-проксимални регион и једноструки трансмбрерански хелик 39. Неструктурирана интрацелуларни регион налази се на Ц-ТЕРМИНУС-у и садржи конзервиране секвенце мотиве који посредују везивање протеина који посредују ефекторски протеин.Регион који се протеже од аминокиселина ~ 1100 до 1600 углавном је поремећен.Открили смо да МКС1 комуницира са РОБО1 путем ИГ, ФН и интрацелуларним доменима, док се већина интеракције са Стат1 јавља између њеног ЦЦД-а, Линкер домена и Ц-терминуса РОБО1 (Сл. 4А, Е).С друге стране, интеракције са ДИ, ДИИИ и ОАС3 Линкер-овим регионима дистрибуирају се у целокупном протеину РОБО1 (Сл. 4а).
Породица о олигоеденилату (ОАС) прикупља и везује интрацелуларне двоструко насуте РНА (ДСРНА), подвргава се конформационим променама и синтетише 2 ', 5'-повезане олигоаденилате (2-5 као) 40.Откривено је да је Међу три врха, ОАС3 показује највећи афинитет за ДСРНА и синтетизује најмање 2-5 као, што може активирати рнасе л и на тај начин ограничити вирусну репликацију 41.Породица ОАС састоји се од полимеразе бета (Пол-β) -Кике нуклеотидне преносне преносне домене.Претходно истраживање показало је да каталитичка активност Ц-терминалног домена (Диии) зависи од домена ДСРНА (ДИ), што је потребно за активирање ОАС342.Приметили смо да ДИ и ДИИ домене ОАС3 интеракције са ЦЦД-ом и малим раскрсницом између СХ2 и Стат1 тад (Слика 4а, Ф).Прекривајући различите бочне странице на структури протеина открили су интеракцију између пет петље и ДБД Стат1 и отворени џеп или шупљину формиране остацима 60-75 у ДИ домену ОАС3 (Сл. 4Г).Оријентација протеина у комплексу такође је указивала да ниједна интеракција са ОАС3 ометају се у ДНК-везујућу способност свог ДИ доменом (Сл. С1а).Поред тога, Н-терминалне домене ГТПАСЕ МКС1 интеракције интеракције са ДИ и ДиИИ доменима ОАС3 (Сл. 4а).Такође смо приметили интеракцију између ОАС1 и МКС1 у сва три понављања у ИФН-у ИФНа-у, где је појединачни домен ОАС1 (такође каталитично активан) интеракција са свим три МКС1 домене (слика С2А, Б).
МКС протеини су део велике породице ГТПАСЕС-ових динаина који садрже н-терминал ГТПАСАСЕ домен који се веже и хидролизује ГТП, средњи домен који посредује самостално склапање и Ц-терминал леуцин патентски затварач који делује као ГТПасе (ЛЗ ).Домен домен домена25,43.МКС1 се веже за подјединице вирусних полимераза за блокирање транскрипције вирусног гене43.Претходно пријављени екран за два хибрида квасаца показао је да ПИАЦС1 придружени МКС1 инхибира активацију гена посредованог Блокирањем дна која везује и такође има Активност лигазе СУМО Е344,45.Ево, демонстрирамо да МКС1 везује на Стат1 (Слика 4Ц, Д), међутим како ова интеракција утиче на Активацију гена посредованог Стат1-ом, као одговор на ИФНα потребно је даље проучавање.Поред тога, открили смо и да је МКС1 интеракција са ИФИТ3 и ДДКС60 у сва три понављања ИФНа-третираног (Сл. С2Ц).
ДДКС60 је цитоплазматска хеликаза изазвана ИФН која је претходно пријављена да игра улогу у опреми и независно од независности вирусног РНА46.Интетрира се са Риг-И и активира свој сигнал на начин специфичан за лиганд 46. ДДКС60 састоји се од домена ДекД / Х-Бок Хелицасе и Ц-Терминал Хелицасе домена који везује вирусну РНА и ДНК47.Већина његових интеракција са МКС1 и ИФИТ3 догађа се у оквиру дугих Н- и Ц-терминалних региона без канонских домена или мотива (Сл. С2Е, Ф).Међутим, МКС1 је такође повезан са доменом ХелиЦасе ДекД / Х-Бок (Сл. С2Е).Протеини породице ИФИТ-а имају тандем копије препознатљиве начине хелик-хелик-хелик-хелик-хелик-а названог тетрапептид понављања (ТПР).ИФИТ3 је откривено да је позитиван модулатор ригор-И сигнализира и отуда се компонента комплекса МАВС.Узети заједно, наши подаци сугерирају да иФиТ3 и ДДКС60 међусобно делују пре свега у региону између ТПР 3-6 од ИФИТ3 и могу да играју улогу у сигнализацији Риг-И / Мавс (Сл. С2Ф).
С обзиром да је скрининг целокупни протеоме рањиво интензиван, затим смо прегледали целу људску унипрот базу података за присуство једног од понављања у ИФН-у.У овој реплици пронашли смо неколико високо поузданих интеракцијских мрежа за ХЛА-а.Анализа протеинских стаза које је идентификована од стране МС / МС Спецтра показала је да је МХЦ-И-Антигенова прерада и презентација главна стаза индукована интерфероном (Сл. 3Д).Стога смо се фокусирали на проучавање протеинских интеракција МХЦ-И молекула са високим степеном поверења у све унакрсне узорене узорке.ХЛА састоји се од домена и лаких лампица и лаких лаких лампица и микробулин β2 (β2м) је константан цхапероне протеин49.Једном је састављен у ендоплазмичком ретикулуму, ХЛА је нестабилна у непостојању пептида лиганди50.Гроове који веже пептид формира се високо полиморфни и неструктуриран α1 и α2 домене у не-пептидном облику и релативно мање полиморфног α351 домена.У присуству ИФНа-а открили смо две ХЛА-а комплексе: један у интеракцију са ХМГА1 и Х2Б (слика 5, Табела С3), а други интеракције са МДН1, ​​ЛРЦХ4 и Х2Б (Слика 6).
ИФНа индукује ХЛА-А интеракциона мрежа са Х2Б (Х2БФС) и ХМГА1.(А) 2Д плац (генерисано у СИМ-КСЛ софтверу) приказује различите врсте интеракције у комплексу Х2Б-ХЛА-А-ХМГА1: Интерлок (плава), интерлик (црвена) и појединачна веза (црна)..Домене различитих идентитета су у боји кодирани32: Х2б (хистон; 2-102) и МХЦ-И (МХЦ_1; 25-203, Група Ц1; 210-290 и МХЦ_И_Ц; 337-364).Претпостављени праг је постављен на 3.5.Дот парцеле означавају ХЛА-а сајтове интеракције са Х2Б (Б) и ХМГА1 (Ц), као и к или с локацијама за интеракцију између два пептида.На слици је праг унакрсног линка постављен на 3.0.(Д) односи између протеина приказаних у структурама протеина Х2Б, Х2Б, ХЛА-А и ХМГА1 у програму Пимол.Ове структуре су моделиране помоћу ПХИРЕ2 сервера (хттп: //ввв.сбг.био.иц.ац.ук/пхире2) и структура предлошка за Х2Б, ХЛА-А и ХМГА1 протеине су 1ККС552, 1КЈ349 и 2ЕЗЕ55, респективно.
ИФНа индукује ХЛА-адресу интеракције са Х2Б (Х2БФС), МДН1 и ЛРЦХ4.(А) интраМолекуларна (црвена) и интермолекуларна (плава) цросслинкс представљена на 2Д интерактивној мапи (генерисано у софтверу СИМ-КСЛ) са МДН1 представљен као круг.Претпостављени праг је постављен на 3.5.Домене различитих идентитета су у боји Кодирани32: Х2Б (хистон; 2-102), МХЦ-И (МХЦ_1; 25-203, Група Ц1; 210-290 и МХЦ_И_Ц; 337-364) и ЛРЦХ4 (ЛРР_8), ЛРР_8 (137-194) и ЦХ (535-641)).(Б) односи између протеина приказаних у структурама протеина Х2Б, Х2Б, Х2Б, ХЛА-А, ЛРЦХ4 и МДН1 у програму Пимол.Ове структуре су моделиране користећи ПХИРЕ2 сервер (хттп: //ввв.сбг.био.иц.ац.ук/пхире2) са структурама предлошка 1ККС552, 1КЈ349, 6ХЛУ62 и 6и2665 за протеине Х2Б, ХЛА-А, ЛРЦХ4 и МДН1, редом.Дот парцеле које приказују К или С веб локације за интеракцију за ХЛА-А са Х2Б (Ц), ЛРЦХ4 (Д) и МДН1 (Е).За парцеле је постављен праг крижне везе на 3.0.
Поред одржавања интегритета генома, хистон Х2Б је такође укључен у регулисање транскрипције.Протеин Х2Б састоји се од централног хистонског домена (ХФД) који је формирала три α-хелиције одвојене петљима и Ц-терминалним репом 41,52.Већина интеракције са Х2Б догађа се у Акинској Арику, која нуди тримеризација са ХФД хетеродимер (Сл. 5а, Б).Иако су лизини укључени у везивање ДНК, неке лизине су такође алтернативна локације ацетилације или метилације.На пример, остаци К43, К46 и К57 из Х2Б нису укључени у директно везивање ДНК, већ су мета разних модификација пост-транскрипција53.Слично томе, остаци К44, К47, и К57 у Х2Б-у могу играти алтернативну улогу у присуству ИФН-а, укључујући интеракције са другим протеинима (Сл. 5а, Б).Поред тога, екстрахромосомални хистон Х2Б активира имуни одговор у разним врстама ћелија, делујући као цитосолични сензор за откривање двоструких фрагмената ДНК (ДСДНА) који потичу из заразних средстава или оштећених ћелија54.У присуству вируса ДНК, Х2Б исцрпљивање инхибира ИФН-β продукција и статистика фосфорилације.Х2б је такође познато да се усели и излази из језгра брже од осталих језграних хистона54.И интеракције Х2Б са МДН1 и ЛРЦХ4 такође су примећене у одабраним необрађеним узорцима.Открили смо да је ХЛА-А интеракција са Х2Б-ом у сва три узорака са ИФН-ом и у једном необрађеном понављању.Ови подаци одражавају улогу Х2Б у алтернативном физиолошком функцији независно од прописа транскрипције.
ХМГА1 (Група са високом мобилношћу на куци 1), у сарадњи са ХЛА-а.Има кисели Ц-терминалски реп и три различита ДБД-а позване на куке јер се везују за мањи утор у богатој регији у ДСДНА55,56.Ово везивање узрокује да се ДНК савија или исправља, омогућавајући канонским факторима транскрипције да приступе његовом консензусном редоследу.Сматра се да је Ц-терминалски реп укључен у интеракције протеинских протеина и регрутовање фактора транскрипције, јер мутанти за брисање терминала не могу да покрену транскрипцију57.Штавише, овај домен садржи неколико сачуваних фосфорилационих локација које су познате подлоге за киназе 58.Посматрали смо ХЛА-А и Х2Б интеракције са ХМГА1 изван Ц-терминалног домена, сугеришући да се Ц-терминал домене углавном користи за везивање фактора транскрипције (Сл. 5а, Ц).ХМГА протеини се такмиче са хистоном Х1 за везивање за Адаптер ДНК, чиме се повећава приступачност57.Слично томе, изгледа да ХМГА комуницира са хистоном Х2Б дуж Линкер ДНК у конкуренцији са хистоном Х1.ХМГБ1 индукује експресију ХЛА-А, -Б и -Ц у дендритиц ћелијама, што је довело до њихове активације59, али интеракција између ХМГ-а и ХЛА није претходно пријављена.Открили смо да ХМГА1 комуницира са АЛГ-ом и α3 доменима ХЛА-А, са већином интеракција изван њеног 3 ДБД (слика 5а, Ц).У нашим рукама је откривено да се ХЛА-А локализује у језгру (подаци нису приказани) и с обзиром да су Х2Б и ХМГА1 присутни и у језгру, ова интеракција вероватно се појављује у језгру.Специфични адукти мерени између Х2Б, ХЛА-А и ХМГА1 приказани су на слици 5Д.
Већина интеракција ХЛА-А са другим протеинима јавља се у оквиру својих домена α1 и α2 и неуређеног Ц-терминалног домена (Сл. 6).У једном од ових примера открили смо да ХЛА-а интеракције са поремећеним Н-терминалним репом ЛРЦХ4 (слика 6а, д).ЛРЦХ4 регулише активирање ТЛР4 и индукцијског цитокина ЛПС, на тај начин модулишу урођени имуни одговор60,61.То је мембрански протеин са девет понављања богатих леуцина (ЛРРС) и хомолошког мотив хомологије у својој ектодомаин, а затим преношењем уграђеног домена (ТМД) 60, 62.Извештава се о ЦХ доменама посредовати интеракције протеина протеина 60.Извођење од око 300 аминокиселина између ЛРР-а и ЦХ домена је релативно доступно, али поремећен.На основу функције неуређених региона као посредника протеинских мрежа протеина и везикуларног превоза, нашли смо да се већина протеинских интеракција догоди у неуређеним регионима.Интеракције са МДН1 дистрибуиране су током дужине протеина, укључујући ЛРР1, ЛРР6, ЦХ домене и случајне регионе, док је Х2Б углавном везана за ЦХ домен (Сл. 6А, Б).Подносно, ниједна интеракција није укључивала ТМЈ, сугеришући специфичност ЦЛМС приступ (слика 6а, б).
МДН1 је такође идентификован као део ХЛА-А протеинске мреже (слика 6а).Припада породици протеина ААА (АТПАСЕ повезане са различитим активностима).Ово је исти Н-Терминал ААА домен који организује хексамерни прстен и уклања скупштински фактор од 60-их 64 рибосомалне подјединице.Чини се да је сличан динаин64,65,66.Поред тога, АСП / ГЛУ Богат је праћен Мидас домен (Метал Ион зависно од зависности).Због велике величине МДН1 (отприлике 5600 аминокиселина) и његова ограничена хомологија са добро протученим протеинима, мало је познато о својој структури и функцији код људи.Идентификовали смо ХЛА-А, Х2Б и ЛРЦХ4 као обвезујуће партнере МДН1 и открили њихову оријентацију као протеинске комплексе у пимолу (Сл. 6А, Б).Ова три протеина комуницирају са ААА доменом, доменом Линкер-а налик динаину и евентуално МИДАС МДН1.У претходном извештају, прочишћавање афинитета мамаца протеина идентификовано МДН1 као протеин повезан са хистоном Х2Б67.Поред тога, недавна студија је такође пријавила интеракцију између МДН-а и ХЛА-Б у ћелијама ХЦТ116 користећи масовну спектрометрију афинитета, подржавајући наше налазе68.Идентификација овог комплекса у узорацима обрађеним ИФНАЦ-ом сугерира улогу МДН1 у интерферон сигнализацији.
Будући да су ХЛА гени високо полиморфни, екстрахирани секвенцирање гласи да се мапирање ХЛА-А, -Б и -Ц из РНА секвенцира података Фло-1 ћелија (подаци нису приказани).Пептидне секвенце у складу са редоследом читањем откривене су значајне разлике између ХЛА-А, -Б и -Ц у регионима у којима су се на ХЛА-А (слика С3).Поред тога, нисмо приметили унакрсно повезивање протеина до протеина молекула Х2Б / ХМГА1 / МДН1 / ЛРЦХ4 / ЛРЦХ4.Ово сугерише да је интеракција протеина нађена између ХЛА-А, МДН1, ​​ЛРЦХ1 и ХМГА1 ХЛА-А Специфична.Поред тога, протеомична анализа нежељених узорака (Табела С4) показала је да ХЛА-А има већу покривеност секвенци у поређењу са ХЛА-Б или ХЛА-Ц.Пептиди су идентификовани за ХЛА-А високу интензитет у ИФН-у и нелеченим узорцима.
Да би се осигурало да овде идентификоване интеракције нису последица неспецифичног умрежавања два протеина у непосредној просторној близини, додатно смо потврдили два нова ХЛА-а интерактивни фактори вршењем испитивања ко-имунопреципитације.Охла - интеракције са ендогеним МДН1 и Х2Б откривене су и у ИФН-у третираним и необрађеним ћелијама Фло-1 (Слика 7, Слика С4).Потврдили смо да ХЛА-А заробили су Х2Б у имунопреципиталима и да је ово удружење последица ИФНа лечења јер је ХЛА-А био одсутан у узоракама имунопреципитата од необрађених ћелија (слика 7а).Међутим, наши подаци сугерирају да ИФНа разликује разликује ХЛА-а везивање за Х2Б и МДН1.ИФНа индукује удруживање између Х2Б и ХЛА-А, али смањује своју повезаност са МДН1.Открили смо да је МДН1 био повезан са ХЛА-А у контролама, а додавање ИФНа је смањило ову интеракцију независно од МДН1 индукције ИФН-а (слика 7б, ц).Поред тога, ХЛА-имунопреципитација заробљена Х2Б у А549 ћелијама (Сл. С4), сугерише да је ова интеракција независна од типа ћелије.Узети заједно, ови резултати подржавају интеракције са међусобним посредованим ХЛА-А са Х2Б и МДН1.
ХЛА-А ко-прочишћава Х2Б и МДН1.Представнички ендогени Х2Б (а) и МДН1 (Б) имуно-блокови били су имунопрецинисани из Фло-1 ћелија третираних ИФНА-а и испитиваним антителама.Мишем и зец ИгГ коришћени су као негативна контрола.(Ц) Релативни износи (унос) различитих антигена приказују имуноблотс сонде од назначених антитела, β-актин је коришћен као контрола оптерећења.
Истражена је структурна својства једне од високо поузданих умрежених умножаних мрежа, Х2Б-ХЛА-А-ХМГА1.Користили смо моделирање молекуларне динамике као алтернативни приступ да бисмо разумели конформациона динамика протеина који су укључени у овај комплекс (слика 8).Загледни подаци ЦЛМС-а сугерирају могућност различитих конформација протеина Х2Б, ХМГА1 и ХМГА1.Стога су следећи потенцијални комплекси моделирани у солвентном медијуму: Х2Б-ХЛА-А, ХМГА1-ХЛА-А и Х2Б-ХЛА-А-ХМГА1.Почетни екран за прикључак за протеински протеин који користи МПЕ (молекуларно окружење у раду; Цхемицал Цомпутинг Гроуп Инц., Монтреал, Куебец, Канада) сугерисали су могуће конформације које се разликују између ових протеина (Сл. 8а).Визуализација прикључног протеинског комплекса открила је неколико интеракција и могућих конформација (слика 5а, 8).Стога је једна могућа конформација приказана на слици 8А (са означеним унакрсним везама) и даље је оцењена помоћу моделирања МД моделирања.Поред тога, везивање Х2Б или ХМГА1 до ХЛА-а наглашава виши афинитет Х2Б за ХЛА-А (Сл. 8а).
Конформациона динамика могућих мрежа између Х2Б (Х2БФС) -ХЛА-А, ХМГА1-ХЛА-А и Х2Б-ХЛА-А-ХМГА1 комплекса.(А) Леви панел је 2Д мапа (генерисана у СИМ-КСЛ софтверу) интрамолекуларних (црвених) и интермолекуларних (плавих) цросслинкса (ЦроссЛинк Цусефф постављена на 3.5).Поред тога, идентификовани су унакрсни остаци означени на структурама Х2Б, ХЛА-А и ХМГА1 протеина.Придружене конформације ових протеина су екстраховане помоћу прикључног цевовода који се спроводи у паковању МП.Доњи леви панел приказује различите могуће уштеде Х2Б-ХЛА-А и ХМГА1-ХЛА-комплексе са различитим афинитетима везујуће протеина (ГБВИ / ВСА ДГ; КЦАЛ / МОЛ).(Б) стандардна девијација (РМСД) атомске позиције (искључујући атоме водоника) за сваку структуру протеина.(Ц) Интермолекуларне протеине протеине интеракције водоничних обвезница од различитих симулираних комплекса с обзиром на одређене интеракције трајања ≥ 10 НС.Удаљеност прекидача за прихватање донатора Х-Бонд је постављена на 3,5 А, а угаони угао преноса донатора је постављен на ≥ 160 ° -180 °.(Д) Означени остаци који формирају ХЛА-протеинске интеракције протеина са својим партнерима, укључујући ≥ 20 НС, екстраховани из комплекса Думми ХЛА-А-Х2Б и ХЛА-А-ХМГА1.Протеинске структуре представљају просечну структуру од 100 НС МДС-а.(Е) интеракције између ХЛА-А-Х2Б и ХЛА-А-ХМГА1 комплекса у поређењу са интеракцијама које је Х2Б-ХЛА-ХЛАГУЛАРНОГ СИМУЛАЦИЈА ГОТХ 100 НС на бази К или С места интеракције између два пептида.Комплекси / ХМГА1-ХЛА-А / Х2Б-ХЛА-А-ХМГА1.Вредност прага за евалуацију унакрсних веза постављена је на 3.0, а узимају се у обзир специфичне интеракције из МДС-а ≥ 10 НС.Протеинске структуре биле су визуализоване коришћењем БИОВИА Дисцовери Студио (Дассаулт Системес, БИОВИА Цорп., Сан Диего, ЦА, САД) и молекуларно окружење (МОЕ; Хемијска рачунарска група Инц., Монтреал, Куебец, Канада) пакети.
Стабилност ХЛА-а молекула током времена (стандардно одступање; РМСД или стандардна девијација; РМСФ) указала је на то да је присуство Х2Б или ХМГА1 протеина у комплексима стабилизовано ХЛА-А (слика 8б, слика С5).Протеин ХМГА1 чврсто се веже на место Б2М-а ХЛА-А, индукцију стабилности ХЛА-а аминокиселине у комплексу ХЛА-А-ХМГА1 или Х2Б-ХЛА-А-ХМГА1 (слика 8б, слика С5).Нарочито је да су остаци ХЛА ~ 60-90 и ~ 180-210 мање флексибилни у присуству Х2Б (Сл. 8б).Х2Б и ХМГА1 показали су боље везивање за Х2Б-ХЛА-А-ХМГА1 комплекс у поређењу са Х2Б-а само за Х2Б или ХМГА1 (слика 8Ц, Д; Табела С5).Остаци који су укључени у водонични везивање (МД моделирани високи попуњеност ≥ 10 НС) који се подударају са ЦЛМС сајтовима интеракције (К или С остацима) у комплексу, сугеришући да су интеракције које су идентификоване од стране ЦЛМ-ова врло поуздане.Поузданост (Сл. 8е).У ЦЛМС-у и МД моделирању, ХЛА-остаци између око 190-210 и око 200-220 аминокиселина везују Х2Б и ХМГА1, респективно (Сл. 8е).
Интеракције протеина протеина формирају динамичке структурне мреже које посредују интрацелуларну комуникацију као одговор на одређене подражаје.Пошто много протеомичних приступа откривају промене у укупном сталном нивоу протеина, динамика интеракције протеина протеина захтијева додатне алате за снимање везивних интерфејса, а ЦЛМС је један такав алат.Интерферонски сигналски систем је цитокинска мрежа која омогућава ћелијама да одговоре на низ животних о еколошким патогеним и унутрашњим патолошким сигналима, кулминирајући у индукцији подскупова протеина индуктибилних интерферона.Примијенили смо ЦЛМС да бисмо утврдили да ли би нове интеракције протеина протеина могли да се идентификују међу панелом протеина индукованих интерфероном.Глобална анализа интерно повезивања протеина у интерферон-одговорној моделу Фло-1 ћелије коришћена је за хватање протеинских комплекса.Вађење триптичних пептида од некрваних и унакрсних ћелија омогућава пребројавање пептида, обогаћивање стаза и дистрибуцију дужине пептида са дефинисаним интензитетом ЛФК.Канонским интерферонским протеинима су идентификовани као позитивна интерна контрола, док су примећени нови интермолекуларни и интрамолекуларни унакрсни адути канонских интерферонских протеина који су подмукли интерферон као што су МКС1, УП18, ОАС3 и Стат1.Истражена су разне структурне карактеристике и интеракције у функционалним областима.
Интеракција између ХЛА-А, МДН1 и Х2Б откривена је имуноблоттинг у Фло-1 и А549 ћелијама третираним и необрађеним са ИФН-ом.Наши резултати истакнуте ону ХЛА-а комплекси са Х2Б на начин зависан од ИФНА-а.Наш рад представља занимљив авениј за даље истраживање ко-локализације ова два комплекса.Било би и занимљиво проширити ЦЛМС приступ плочу ћелијских линија да идентификује интеракције независне интерферон-посредоване интерфероном типа.Коначно, користили смо МД моделирање као алтернативни приступ да бисмо разумели конформациона динамика протеина укључених у Х2БФС-ХЛА-А-ХМГА1 комплекс, који је пратио интрамолекуларне и интермолекуларне унакрсне разговоре.Ослоњавање из ЦЛМС података сугеришу могућност различитих конформација Х2БФС, ХЛА-А и ХМГА1 протеина.Могуће различите конформације између ових прикључних протеинских комплекса откриле су неколико интеракција сличних онима које су примећене у ЦЛМС базама.Једна од главних снага наше методе је да омогућава лако идентификацију интеракције високо полиморфних гена као што је ХЛА, тако да ће бити занимљиво проучавати интеракције протеина специфичних за ХЛА који су иначе тешко проучити.Узети заједно, наши подаци показују да се ЦЛМС може користити за проширење нашег разумевања сигналних мрежа изазваних интерфероном и пружити основу за проучавање сложених међучелијских система у микроенизору тумора.
Фло-1 ћелије су добијене од АТЦЦ-а и одржавају се у ДМЕМ-у (Гибцо) допуњеном 1% пеницилином / стрептомицином (Инвитроген), 10% серума феталног говеда (Гибцо) и сачувана на 37 ° Ц и 5% ЦО2.Инкубација.Ћелије су порасле на 70-80% ушла пре него што се третира са ИФНа14 (произведени Единбургх Протеиин Продуцтион Продуцтион).Све остале хемикалије и реагенси купљени су од Сигме Алдриха, осим ако није другачије наведено.
ЦЛО-1 ћелије су култивисане у плочицима са 6 јажица и сутрадан ће ћелије третирати са 10 нг / мл ИФНа14 током 24 сата до отприлике 80% ушће.Ћелије су испрно испрно са ПБС-ом и лигиране свеже припремљеном ДСС-ом (Термо Фисхер Сциентифиц) (растворена у ДМСО-у) у ПБС-у на 37 ° Ц. до крајње концентрације од 0,5 мм.Реакција умрежавања ДСС-а замењена је ПБС-ом и преостала ДСС је угашена додавањем ТРИС-а од 20 мм (ПХ 8.0) у ПБС-у на 15 мин на 37 ° Ц.Ћелије су сакупљене стругањем и прикупљеним у ниским цевима везивања (Акиген).
Ћелијска пелета је лизирана са 300 ул багера за лизу уреа (8 м уреа, 0,1 м Трис, пХ 8.5) током 30 мин на собној температури са повременим тресењем.Све кораке центрифугирања изведене су на 14.000 кг на 8 ° Ц.Центрифуга Лизат 10 минута и пребаците супернатант у нову цев.Преостале бистре честице су растворене у 150 уЛ другог пуфера за лизу (2 м урее, 2% (В / В) СДС (натријум додецил сулфат)) 30 минута или више док се не добије хомогено водени раствор.Лизат је центрифугиран током 20 минута и супернатант је помешан са лизатом добијеном у претходном кораку.Концентрације протеина процењене су помоћу микро БЦА теста (термо фишер научно) према упутствима произвођача за процедуре микроплата.Узорци су брзо смрзнути у течном азоту и чувају се на -80 ° Ц.
Отприлике 100 μг растворљивог унакрсног протеина прерађено је коришћењем модификоване протокола за припрему узорка филтрације (ФАСП) како је описано Висниевски ет ал.69 Укратко, протеин је умрежен са 200 уЛ бафера урее (8 м урее у 0,1 м Трис, пХ 8.5), вртложен и преполовљен.Сви кораци центрифугирања изведени су на 14.000 кг на 25 ° Ц.Прва половина умрежених протеинских лизата пребачена је на 10 КДА микроконо центрифугални уређај за филтер који је опремљен ултрацел-10 мембраном (Мерцк), а затим центрифугирање на филтеру на 25 минута.Затим додајте другу половину протеина у филтер и поновите исте кораке.Опоравак протеина обављен је додавањем 100 ул од 17 мм ТРИС (2-карбоксиетил) фосфин хидрохлорида (ТЦЕП) у пуферу за урее.Опоравак је мешан на термомиксер-у на 600 о / мин током 30 мин на 37 ° Ц.Поред тога, колона је центрифугирана, а смањени ум повезних укрштених је био алкилиран помоћу 100 ул 50 мм Иодоацетамид у пуферу урее.Реакција алкилације је извршена на собној температури током 20 минута у мраку.Закрените колону, оперите зидове колоне 3 пута са 100 ул уреа пуфера, а затим центрифуге.Иста операција је изведена 3 пута користећи 100 ул 100 мм амонијум бикарбоната.Пре трипсинизације, замените цев за наплату новим.Додајте пуфер за варење који садржи 50 мм амонијум бикарбонат и 1 ул трипсин разблажен у пуферу Трипсин (Промега).Однос трипсина у протеин одржаван је око 1:33, а реакције варења су инкубиране преко ноћи на 37 ° Ц. у влажној комори.Укрштени пептид је елуиран из филтера центрифугирањем током 25 минута.Пептидни опоравак је побољшан додавањем 50 ул од 0,5 м НаЦл у филтер, а затим централно 25 минута.
Ц18 Мицро Спин ступци (Харвард апарат) коришћени су за помножене триптичке пептиде који су помно повезани након протокола који је описао Боуцхал ет ал.70 са мањим модификацијама.Укратко, Ц18 Спин ступци су активирани са три испирања од 0,1% мравље киселине (ФА) у ацетонитрилу (АЦН) (Мерцк) и две прање од 0,1% ФА.Колона је хидрирана са 0,1% ФА током 15 минута.Учитајте узорке у Спин ступце и опрати 3 пута са 0,1% ФА.Одушени пептиди су секвенцијално елуетирани са поступним градијентним градијентом користећи 50%, 80% и 100% АЦН у 0,1% ФА.Узорци су осушени у концентратору Спеедвац плус (Еппендорф) док преостала течност потпуно не нестане.Елуирани пептиди су растворени у 100 ул од 0,08% трифлуоросирћетне киселине у 2,5% АЦН-у и концентрације су мерене на Нанодроп 2000 (термоуцифицијско научно).Отприлике 1 μг умреженог пептида по узорку убризгано је у ЛЦ-МС / МС систем.
Укрштени пептиди су одвојени на врхунском 3000 РСЛЦНАНО ЛЦ систему (термо научно) повезани са масеним спектрометром масе Орбитрап Екплорис 480 (Тхермо Сциентифиц).Укрштени пептиди су сакупљени на 300 μМ ИД-у, 5 мм дугим ступом Ц18 Ц18 Снимање за хватање Ц18 Пепмап100 Сорбент и 5 уМ Пепмап Сорбент (Тхермо Сциентифиц).Уметните проток пумпе постављено на 5 ул / мин 0,08% трифлуоросирћетна киселина растворена у 2,5% АЦН.Укрштени пептиди су раздвојени на аналитичкој фузионисној силици са са унутрашњим пречником од 75 μм и дужине 150 мм, испуњено са сорбент од 2 уМ Пепмап (термо научно).Мобилне фазе А и Б састојале су се од 0,1% ФА у води и 0,1% ФА у ацетонитрилу, респективно.Градиент почиње од 2,5% Б и повећава се линеарно на 40% Б током 90 минута, затим на 90% Б током наредних 2 минута.Композиција мобилне фазе одржавана је на 90% Б током 10 минута, а затим се смањила на линеарно на 2,5% Б током 2 минута.Колона је била равнотежа на 2,5% Б током 8 минута пре следећег циклуса.Укрштени пептиди елуирани из аналитичке колоне били су јонизовани у извору наноелектроспраи и убризгане у екплорис 480 масене спектрометар (термо научна).
Орбитрап Екплорис 480 масени спектрометар који је управљао у позитивном режиму корелације података.Потпуно скенирање извршено је у режиму секције по резолуцији 120.000 са поставкама распона од м / з 350 тх до м / з 2000 тх.Нормализовани АГЦ циљ постављен је на 300% са максималним временским временом од 50мс.Основана је моноисотопна вршна откривање за пептиде.Параметар опуштања ограничења постављен је на ТРУЕ ако се нађе премало прекурсора.Минимална јонска јачина прекурсора била је постављена на 5.0Е3 и прекуронска накнада на +8 је укључена у експерименте.
Време циклуса између главних скелата у режиму корелације података је постављено на 2,5 секунде.Динамична масовна искљученост је постављена на 20 с након прве фрагментације прекурсор иона.Прозор изолације прекурсора је постављен на 2. годину.Врста нормализоване енергије судара са режим фиксног судара изабрана је у режим зависног од података МС / МС Сцан.Енергија судара постављена на 30%.Резолуција орбитрап је постављена на 15.000 и АГЦ циља на 100%.Прилагођена максимална времена убризгавања постављена је на 60 милисекунди.
Пре праћења мреже протеина протеина у унакрсним узорцима, обрадили смо сирове датотеке користећи пакет Маккуант (верзија 1.6.12.0) 26,27 за идентификацију пљесне пептиде / протеина у узорцима.Поред тога, сличне протеомијске анализе извршене су на нецросслинкед фло-1 узорака третираним и необрађеним са ИФН-ом.МС / МС подаци се претраже у унипрот људској бази података (ввв.унипрот.орг) (уплоад 12. августа 2020., садржи 75.093 уноса) помоћу уграђеног претраживача АНДРОМЕДА27.Претрага је извршена без указивања на специфичност ензима и разних модификација деамидације (н, к) и оксидације (м).Прекурсорске масовне толеранције постављене су на 20 ппм и јона производа на 0,02 да.Почетна и максимална масовна девијација постављена је на 10 ппм.Максимална маса пептида постављена је на 4600 ДА и сличност секвенце је постављена између 7 и 25 аминокиселина (АА).Даљња статистичка анализа извршена је коришћењем програма Персеус (верзија 1.6.10.45).Садржај протеина израчунат је нормализацијом спектралног интензитета протеина (ЛФК интензитет; необележени квантификација) 27 и вредности интензитета претворене су у Лог2.Хијерархијска кластеривање протеина који су идентификовани по интензитету пептида изграђене је коришћењем пакета ПхеатМап (В1.0.12) у Р (В 4.1.2).Анализа обогаћивања стаза обављена је коришћењем базе података РеацтАцт-а за протеине који се обрађује ИФНА-е који су били више од четири пута активиране у поређењу са необрађеним узорцима.
Идентификација лизина (к) или серинских (и) специфичних хемијских крижања протеинских комплекса које је надгледала ЛЦ-МС / МС је извршена коришћењем спектроскопске идентификационе машине (СИМ-КСЛ) за умрежене пептиде (СИМ-КСЛ) 29.Прво, могуће је истражене могуће интеракције између интерферонског повезаног (ИФН) ДНК-а за отпорност на оштећења (ИРД) (ИРД), коришћењем ИРДС протеинских датасет-а описаних у Падарииа ет ал.28.Скривање свих услова и понављања целог човека Унипрота је рачунално интензивно, тако да је целокупна људска унипрот база података (ввв.унипрот.орг) (преузет 12. августа 2020., садржи 75.093 уноса) против понављања у ИФНА-у.Један од филтера за високо поверење интеракције.Ове добијене интеракције високих значаја проширене су и тестиране у свим понављањима и условима.
У СИМ-КСЛ-у је коришћена ДСС-а за ЦроссЛинкер (КСЛ) и КСЛ Померање тежине тежине и модификације помак је постављено на 138,06 и 156,07, респективно.Сљедеће се реакционе места за умрежавање разматране су: КК, КС и КН-рок, без репортерних јона.И прекурсор и фрагмента ППМ постављени су на 20 и Креа праг је постављен на 0,15.Трипсин је сматран у потпуности специфичан, а реализована је фрагментација фрагментације високоенергетске Ц-замке (ХЦД).КСЦОРР Динамиц ДБ праг смањења и минимални број пептида за динамички смањење ДБ-а постављени су на 2,5 и 2, респективно.Остали параметри су: вероватноћа моноизотопа и врхунска средства за случајност, минимум 4 АА остаци по прави и максималној наплаћиној пуњињу и 3 макима пропуштених раздвајања.Добијени ушивене 2Д карте анализиране су у (СИМ-КСЛ) и КСКУЕСТ28 графичка заступљеност коришћена је за изградњу 2Д мапа.Протеинске крижање на протеинским структурама дате су у Пимолу (Пимол Молекулар Графички систем, верзија 2.0 Сцхродингер, ЛЛЦ).
Структуре модела протеина креиране су коришћењем ПХИРЕ2 сервера (хттп: //ввв.сбг.био.иц.ац.ук/пхире2)11 Коришћење принципа хомолошког моделирања и примене "Хидден Марков метода".Пхире2 генерише моделне структуре засноване на поравнавању секвенци са познатим протеинским структурама.За Х2БФС, ХЛА-А, ХМГА1, ЛРЦХ4 и МДН1 протеине, структуре предлошка 1ККС552, 1КЈ349, 2ЕЗЕ52, 6ХЛУ62 и 6И2665.Поред тога, разматрана је и структура алпхафалд71 МКС1, УБП18 и РОБО1.Структура протеина била је визуализована коришћењем пакета Висуализерског визуализатора Биовиа Дисцовери (Дассаулт Системес, БИОВИА, Сан Диего, ЦА, САД) и молекуларни пакет окружења (мое; хемијска рачунарска група Инц., Монтреал, Куебец, Канада).