347 12,7 * 1,24 мм Намотана цев од нерђајућег челика, молекуларни механизам синхроне електростатичке кондензације и коагрегације α-синуклеина и тау

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Клизачи који приказују три чланка по слајду.Користите дугмад назад и следећи да бисте се кретали кроз слајдове или дугмад контролора слајдова на крају да бисте се кретали кроз сваки слајд.

Спецификација цеви од нерђајућег челика 347

347 12.7*1.24мм Намотана цев од нерђајућег челика

Спољни пречник: 6,00 мм ОД до 914,4 мм ОД, величине до 24” НБ доступне на залихама, ОД величина челичне цеви доступне на залихама

СС 347 Опсег дебљине цеви: 0,3 мм – 50 мм, СЦХ 5, СЦХ10, СЦХ 40, СЦХ 80, СЦХ 80С, СЦХ 160, СЦХ КСКСС, СЦХ КСС
ВТ: СЦХ5С, СЦХ10С, СЦХ40С, СЦХ80С, СЦХ160С, итд. (0,5-12 мм) Или нестандардна величина која се прилагођава према потреби

Тип: СС 347 бешавне цеви |СС 347 ЕРВ цеви |СС 347 Заварене цеви |СС 347 Фабрицатед Пипес |СС 347 ЦДВ цеви, ЛСАВ цеви / заварене шавовима / поново нацртане

Облик: СС 347 округле цеви/цеви, СС 347 квадратне цеви/цеви, СС 347 правоугаоне цеви/цеви, СС 347 намотане цеви, СС 347 "У" облик, СС 347 завојнице за колаче, СС 347 хидрауличне цеви

Дужина: појединачни случајни, двоструки насумични и крај обавезне дужине: обичан крај, закошени крај, удубљени

Енд Протецтион: Пластиц Цапс |Спољна завршна обрада: 2Б, бр.4, бр.1, бр.8 Огледало за цеви од нерђајућег челика, завршна обрада према захтевима купца

Услови испоруке: жарено и кисело, полирано, светло жарено, хладно вучено

Инспекција, извештаји о испитивању: сертификати о испитивању млина, ЕН 10204 3.1, хемијски извештаји, механички извештаји, извештаји о испитивању ПМИ, извештаји о визуелној инспекцији, извештаји о инспекцији треће стране, лабораторијски извештаји одобрени НАБЛ, извештаји о деструктивним испитивањима, извештаји о неразорним испитивањима

Паковање: Паковано у дрвене кутије, пластичне кесе, челичне траке у пакету или према захтевима купаца

Посебности: величине и спецификације које нису горе наведене могу се произвести на захтев

СС 347 Опсег величине цеви: 1/2 инча НБ, ​​ОД до 24 инча

АСТМ А312 347: Бешавне и правошавне заварене аустенитне цеви намењене за високе температуре и опште корозивне услове.Додатни метал није дозвољен током заваривања.

АСТМ А358 347: Аустенитна цев заварена електричном фузијом за корозивне и/или високе температуре.Обично се само цев до 8 инча производи према овој спецификацији.Дозвољено је додавање додатног метала током заваривања.

АСТМ А790 347: Бешавне и равно шавне заварене феритне/аустенитне (дуплексне) цеви намењене за општу употребу у корозивним условима, са посебним нагласком на отпорност на пуцање од корозије под напоном.

АСТМ А409 347: електричним фузијом заварене аустенитне цеви великог пречника од 14” до 30” са равним или спиралним шавом у величинама од 14” до 30” са зидовима Сцх5С и Сцх 10С за корозивне и/или високе

АСТМ А376 347: Бешавне аустенитне цеви за примену на високим температурама.

АСТМ А813 347: Једношавна, једноструко или двоструко заварена аустенитна цев за високе температуре и опште корозивне примене.

АСТМ А814 347: Хладно обрађена заварена аустенитна цев за високе температуре и општу корозивну употребу.

Хемијски састав цеви од нерђајућег челика 347Х

Механичка својства цеви од нерђајућег челика 347Х

Физичка својства цеви од нерђајућег челика 347Х

Еквивалентне оцене за цеви од нерђајућег челика 347Х

Агрегација амилоида алфа-синуклеина (αС) је обележје Паркинсонове болести и других синуклеинопатија.Недавно је тау протеин који се обично повезује са Алцхајмеровом болешћу повезан са αС патологијом и утврђено је да се ко-локализује у инклузијама богатим αС, иако молекуларни механизам коагрегације ова два протеина остаје нејасан.Овде извештавамо да се αС фаза раздваја у течне кондензате путем кондензације електростатичког комплекса са позитивно наелектрисаним полипептидима као што је тау.У зависности од афинитета αС за поликатионе и брзине исцрпљивања валентности коагулационе мреже, угрушци се подвргавају брзој гелацији или коалесценцији праћеној спором агрегацијом амилоида.Комбиновањем скупа напредних биофизичких техника, успели смо да окарактеришемо течно-течно раздвајање αС/Тау фазе и идентификујемо кључне факторе који доводе до формирања хетерогених агрегата који садрже оба протеина у течном протеинском кондензату.
Поред мембранских одељака, просторно раздвајање у ћелијама се такође може постићи формирањем густих тела богатих протеинима, налик течностима, названих биомолекуларни кондензати или капљице, кроз процес познатог као раздвајање фазе течност-течност (ЛЛПС).Ове капљице се формирају мултивалентним временским интеракцијама, обично између протеина или протеина и РНК, и служе за различите функције у скоро свим живим системима.Велики број протеина способних за ЛЛП показује секвенце ниске сложености које су веома поремећене у природи иу формирању биомолекуларних кондензата3,4,5.Бројне експерименталне студије су откриле флексибилну, често поремећену и мултивалентну природу протеина који чине ове кондензате сличне течности, иако се мало зна о специфичним молекуларним детерминантама које контролишу раст и сазревање ових кондензата у чврсте кондензате. држава..
Нови подаци подржавају хипотезу да аберантни протеински вођени ЛЛПС и трансформација капљица у чврсте структуре могу бити релевантни ћелијски путеви који воде до стварања нерастворљивих токсичних агрегата који су често обележја дегенеративних болести.Многи интринзично поремећени протеини (ИДП) повезани са ЛЛПС-ом, често високо наелектрисани и флексибилни, дуго су повезани са неуродегенерацијом кроз процес агрегације амилоида.Конкретно, показало се да биомолекуларни ИДП кондензати као што су ФУС7 или ТДП-438 или протеини са великим доменима ниске сложености, као што је хнРНПА19, старе у гелу или чак чврсте форме кроз процес који се назива флуидизација.сложени.у чврсту фазну транзицију (ЛСПТ) као функцију времена или као одговор на одређене пост-транслационе модификације или патолошки значајне мутације1,7.
Још један ИДП повезан са ЛЛПС ин виво је Тау, поремећени протеин повезан са микротубулама чија је агрегација амилоида умешана у Алцхајмерову болест10, али је такође недавно умешана у Паркинсонову болест (ПД) и друге синаптичке нуклеарне протеинопатије 11, 12, 13 су повезане.Показало се да се тау спонтано одваја од раствора/цитоплазме због повољних електростатичких интеракција14, што доводи до формирања капљица обогаћених тауом познатих као електростатички коацервати.Такође је примећено да је ова врста неспецифичне интеракције покретачка снага многих биомолекуларних кондензата у природи15.У случају тау протеина, електростатичка агрегација се може формирати једноставном агрегацијом, у којој супротно наелектрисани региони протеина покрећу процес цепања, или комплексном агрегацијом кроз интеракцију са негативно наелектрисаним полимерима као што је РНК.
Недавно је α-синуклеин (αС), амилоидни ИДП који је умешан у ПД и друге неуродегенеративне болести које су заједно познате као синуклеинопатија17,18, демонстриран у ћелијским и животињским моделима19,20 концентрисаним у протеинским кондензатима са понашањем сличним течности.Ин витро студије су показале да αС пролази кроз ЛЛПС једноставном агрегацијом кроз претежно хидрофобне интеракције, иако овај процес захтева изузетно високе концентрације протеина и атипично дуга времена инкубације19,21.Да ли су кондензати који садрже αС примећени ин виво формирани овим или другим ЛЛПС процесима остаје кључно нерешено питање.Слично томе, иако је агрегација амилоида αС уочена у неуронима у ПД и другим синуклеинопатијама, тачан механизам помоћу којег αС пролази кроз интрацелуларну агрегацију амилоида остаје нејасан, јер изгледа да прекомерна експресија овог протеина не покреће овај процес сама.Често је потребно додатно оштећење ћелија, што сугерише да су одређене ћелијске локације или микроокружења потребне за ренуклеацију интрацелуларних αС амилоидних склопова.Једно ћелијско окружење које је посебно склоно агрегацији може бити унутрашњост протеинских кондензата 23 .
Занимљиво је да је откривено да се αС и тау ко-локализују у карактеристичним инклузијама болести код људи са Паркинсоновом болешћу и другим синуклеинопатијама 24,25, а експерименти су известили о синергистичкој патолошкој вези између два протеина 26,27 што сугерише потенцијалну везу између агрегације αС и тау код неуродегенеративних болести.болест.Утврђено је да αС и тау интерагују и промовишу међусобну агрегацију ин витро и ин виво 28,29 и уочени су хетерогени агрегати састављени од ова два протеина у мозгу пацијената са синуклеинопатијама 30 .Међутим, мало се зна о молекуларној основи интеракције између αС и тау и механизму његове коагрегације.Пријављено је да αС ступа у интеракцију са тау кроз електростатичку привлачност између високо негативно наелектрисаног Ц-терминалног региона αС и централног региона тау богатог пролином, који је такође обогаћен позитивно наелектрисаним остацима.
У овој студији показујемо да αС заиста може да се дисоцира у капљице путем кондензације електростатичког комплекса у присуству тау протеина, за разлику од његове интеракције са другим позитивно наелектрисаним полипептидима као што је поли-Л-лизин (пЛК), иу овом процесу .αС делује као молекул скеле за мрежу капљица.Идентификовали смо приметне разлике у процесу сазревања електростатичких αС коацервата, које су повезане са разликама у валентности и јачини интеракције протеина укључених у коацерватну мрежу.Занимљиво је да смо приметили коагрегацију αС и тау амилоидних протеина у дуготрајним течним коацерватима и идентификовали неке кључне факторе који доводе до коагрегације ова два протеина у таквим коацерватима.Овде смо детаљно описали овај процес, који је могући молекуларни механизам који лежи у основи колокализације два протеина у инклузијама специфичним за болест.
αС има високо ањонски Ц-терминални реп при неутралном пХ (слика 1а), а ми смо претпоставили да би могао да прође кроз ЛЛПС кроз кондензацију електростатичких комплекса са поликатионски поремећеним полипептидним молекулима.Користили смо поли-Л-лизин са 100 остатака (пЛК) као почетни модел молекула због његове позитивно наелектрисане и поремећене полимерне природе на неутралном пХ 32. Прво смо потврдили да пЛК интерагује са Цт доменом αС путем НМР спектроскопије раствора (Слика 1б) коришћењем αС обележеног 13Ц/15Н у присуству растућих моларних односа αС:пЛК.Интеракција пЛК са Цт-доменом αС манифестује се у пертурбацијама хемијског померања и смањењу интензитета пика у овом региону протеина.Занимљиво, када смо помешали αС са пЛК у концентрацији αС од прибл.5–25 µМ у присуству полиетилен гликола (5–15% ПЕГ-8) (типични ЛЛПС пуфер: 10 мМ ХЕПЕС пХ 7,4, 100 мМ НаЦл, 15% ПЕГ-8) одмах смо прошли кроз широко поље формирања протеина .капљице су примећене коришћењем флуоресцентне (ВФ) и микроскопије светлог поља (БФ) (слика 1ц).Капљице величине 1-5 µм које садрже концентровани αС (додат је 1 µМ АлекаФлуор488 означен αС, АФ488-αС), њихова електростатичка својства могу се извести из њихове отпорности на 10% 1,6-хександиола (1,6-ХД) и његове осетљивости на повећање концентрације НаЦл (слика 1ц).Природа коацервата αС/пЛК електростатичког комплекса налик на течност показује се њиховом способношћу да се стапају у року од милисекунди (слика 1д).Користећи турбидиметрију, квантификовали смо формирање капљица у овим условима, потврдили електростатичку природу главне интеракције повезане са њеном стабилношћу (слика 1е) и проценили утицај различитих односа полимера на процес ЛЛПС (слика 1ф).Иако се формирање капљица примећује у широком опсегу односа полимера, процес је веома повољан када је пЛК већи од αС.ЛЛП-ови су такође примећени коришћењем хемијски различитог замењивачког агенса декстран-70 (70 кДа) или коришћењем различитих формата узорака, укључујући капљице стаклених плочица, отворе за микроплоче од различитих материјала, Епендорф или кварцне капиларе.
а Шематски приказ различитих региона протеина у варијантама ВТ-αС и ΔЦт-αС коришћеним у овој студији.Амфипатски Н-терминални домен, регион који формира хидрофобни амилоид (НАЦ) и негативно наелектрисани Ц-терминални домен приказани су плавом, наранџастом и црвеном бојом.Приказана је мапа Нето Цхарге Пер Ресидуал (НЦПР) за ВТ-αС.б НМР анализа αС/пЛК интеракције у одсуству макромолекуларних накупина.Како концентрација пЛК расте (моларни односи αС:пЛК од 1:0,5, 1:1,5 и 1:10 приказани су у светло зеленој, зеленој и тамнозеленој боји).ц Коацерватирајте αС/пЛК (моларни однос 1:10) на 25 µМ (1 µМ αС означен АФ488 или Атто647Н означен пЛК за ВФ снимање) у ЛЛПС пуферу (горе) или допуњен са 500 мМ НаЦл) или после 10 % 1,6-хександиол (1,6-ХД; доле десно).Скала бар = 20 µм.д Репрезентативне микроскопске слике фузије БФ капљица αС/пЛК (моларни однос 1:10) при концентрацији од 25 μМ;стрелице означавају спајање појединачних капи (црвена и жута стрелица) у нову кап (наранџаста стрелица) у року од 200 мс).Скала бар = 20 µм.е Расипање светлости (на 350 нм) αС/пЛК агрегација у ЛЛПС пуферу пре и после додавања 500 мМ НаЦл или 10% 1,6-ХД на 25 µМ αС (Н = 3 понављања узорка, такође су назначена средња вредност и стандардна девијација).ф БФ слика (горе) и анализа расејања светлости (на 350 нм, доле) агрегације αС/пЛК на 25 μМ αС са повећањем моларног односа αС:пЛК (Н = 3 понављања узорка, такође су назначена средња вредност и стандардна девијација).Скала бар = 10 µм.Скала на једној слици означава размеру свих слика на једном панелу.Необрађени подаци се пружају у облику датотека необрађених података.
На основу наших запажања кондензације електростатичког комплекса αС/пЛК и претходних запажања αС као клијентског молекула кондензата тау/РНА кроз директну интеракцију са тау31, претпоставили смо да би αС и тау могли ко-сегрегирати са растварачем у одсуству РНК кондензација.кроз електростатичке комплексе, а αС је протеин скеле у αС/Тау коацерватима (види дистрибуцију тау набоја на слици 2е).Приметили смо да када су 10 μМ αС и 10 μМ Тау441 (који садрже 1 μМ АФ488-αС и 1 μМ Атто647Н-Тау, респективно) помешани заједно у ЛЛПС пуферу, они лако формирају протеинске агрегате који садрже оба протеина, као што се види микроскопијом ВФ.(слика 2а).Колокализација два протеина у капљицама потврђена је конфокалном (ЦФ) микроскопијом (додатна слика 1а).Слично понашање је примећено када је декстран-70 коришћен као агенс за агрегацију (додатна слика 1ц).Користећи ПЕГ или декстран са ФИТЦ-ом, открили смо да су оба средства за гужву равномерно распоређена по узорцима, не показујући ни сегрегацију ни повезаност (додатна слика 1д).Уместо тога, то сугерише да у овом систему они промовишу раздвајање фаза кроз макромолекуларне ефекте гужве, пошто је ПЕГ првенствено стабилан агенс гужве, као што се види у другим ЛЛП системима33,34.Ове капљице богате протеинима биле су осетљиве на НаЦл (1 М), али не и на 1,6-ХД (10% в/в), потврђујући њихова електростатичка својства (додатна слика 2а, б).Њихово течно понашање је потврђено посматрањем милисекундних догађаја спајања капљица коришћењем БФ микроскопије (слика 2б).
а Конфокална (ЦФ) микроскопска слика αС/Тау441 коацервата у ЛЛПС пуферу (10 μМ сваког протеина, 0,5 μМ αС обележеног АФ488 и Тау441 обележеног Атто647Н).б Репрезентативне слике диференцијалног контраста интерференције (ДИЦ) догађаја фузије αС/Тау441 капљица (10 μМ за сваки протеин).ц Фазни дијаграм заснован на расејању светлости (на 350 нм) Тау441 ЛЛПС (0–15 µМ) у одсуству (лево) или присуству (десно) 50 µМ αС.Топлије боје указују на веће расипање.д Расипање светлости узорака αС/Тау441 ЛЛПС са повећањем концентрације αС (Тау441 на 5 µМ, Н = 2–3 понављања узорка као што је назначено).е Шематски приказ неких варијанти тау протеина и различитих региона протеина коришћених у овој студији: негативно наелектрисани Н-терминални домен (црвени), регион богат пролином (плави), домен за везивање микротубула (МТБД, истакнут наранџастом) и спирала пара која формира амилоид.региони филамента (ПХФ) који се налазе унутар МТБД (сиво).Приказана је мапа Нето Цхарге Пер Ресидуе (НЦПР) за Тау441.ф Коришћењем 1 µМ αС обележеног АФ488 и ΔНт- обележеног Атто647Н, коришћењем 1 µМ αС обележеног АФ488 или ΔЦт-αС у присуству ΔНт-Тау (горе, 10 μМ по протеину) или К18 µМ протеина ) ) ) микрографије ВФ кондензоване у ЛЛПС или К18 пуферу.Скала на једној слици представљају скалу свих слика на једном панелу (20 µм за панеле а, б и ф).Необрађени подаци за панеле ц и д су дати као датотеке необрађених података.
Да бисмо тестирали улогу αС у овом ЛЛПС процесу, прво смо истражили ефекат αС на стабилност капљица нефелометријом користећи растуће концентрације НаЦл (слика 2ц).Што је већа концентрација соли у узорцима који садрже αС, то су веће вредности расејања светлости (на 350 нм), што указује на стабилизацијску улогу αС у овом ЛЛПС систему.Сличан ефекат се може приметити повећањем концентрације αС (а тиме и односа αС:Тау441) на прибл.Повећање од 10 пута у односу на концентрацију тау (5 µМ) (слика 2д).Да бисмо показали да је αС протеин скеле у коацерватима, одлучили смо да истражимо понашање ЛЛПС-поремећеног Тау мутанта, коме недостаје негативно наелектрисан Н-терминални регион (остаци 1–150, видети слику 2е) назван ΔНт-Тау.ВФ микроскопија и нефелометрија потврдили су да сам ΔНт-Тау није прошао кроз ЛЛПС (слика 2ф и додатна слика 2д), као што је раније објављено 14. Међутим, када је αС додат дисперзионим растворима ове скраћене Тау варијанте, ЛЛПС процес је био потпуно обновљено са густином капљица блиском густини капљица раствора Тау и αС пуне величине под сличним условима и концентрацијама протеина.Овај процес се такође може посматрати у условима ниске макромолекуларне гужве (додатна слика 2ц).Улога Ц-терминалног αС региона, али не целе његове дужине, у ЛЛПС процесу је демонстрирана инхибицијом формирања капљица коришћењем скраћене αС варијанте Ц-терминала којој недостају остаци 104–140 (слика 1а) (ΔЦт- αС) протеин (слика 2ф и додатна слика 2д).Колокализација αС и ΔНт-Тау потврђена је конфокалном флуоресцентном микроскопијом (додатна слика 1б).
Да би се даље тестирао ЛЛПС механизам између Тау441 и αС, коришћена је додатна Тау варијанта, односно фрагмент језгра упарене спиралне филаменте (ПХФ) у домену за везивање микротубула (МТБД), који ако садржи четири карактеристична поновљена домена, опште позната и као фрагмент К18 (види слику 2е).Недавно је објављено да се αС првенствено везује за тау протеин који се налази у домену богатом пролином у секвенци која претходи домену за везивање микротубула.Међутим, ПХФ регион је такође богат позитивно наелектрисаним остацима (види слику 2е), посебно лизином (15% остатака), што нас је навело да тестирамо да ли овај регион такође доприноси кондензацији αС / Тау комплекса.Приметили смо да сам К18 не може да изазове ЛЛПС у концентрацијама до 100 μМ у тестираним условима (ЛЛПС пуфер са 15% ПЕГ или 20% декстрана) (Слика 2ф).Међутим, када смо додали 50 µМ αС на 50 µМ К18, брзо формирање протеинских капљица које садрже К18 и αС примећено је нефелометријом (додатна слика 2д) и ВФ микроскопијом (слика 2ф).Као што се очекивало, ΔЦт-αС није успео да обнови ЛЛПС понашање К18 (слика 2ф).Примећујемо да агрегација αС/К18 захтева нешто веће концентрације протеина да би изазвала ЛЛПС у поређењу са αС/ΔНт-Тау или αС/Тау441, под условом да су остале једнаке.Ово је у складу са јачом интеракцијом αС Ц-терминалног региона са Тау доменом богатим пролином у поређењу са доменом који се везује за микротубуле, као што је претходно описано 31 .
С обзиром на то да ΔНт-Тау не може да изведе ЛЛПС у одсуству αС, изабрали смо ову Тау варијанту као модел за карактеризацију αС / Тау ЛЛПС с обзиром на његову једноставност у ЛЛПС системима са Тау пуне дужине (изотип, Тау441 / Тау441).са сложеним (хетеротипским, αС/Тау441) процесима агрегације.Упоредили смо степен агрегације αС (као део протеина кондензоване фазе, фαС,ц) у αС/Тау и αС/ΔНт-Тау системима центрифугирањем и СДС-ПАГЕ анализом дисперговане фазе (видети 2е), пронашли смо веома сличне вредности за све протеине у истој концентрацији.Конкретно, добили смо фαС,ц 84 ± 2% и 79 ± 7% за αС/Тау и αС/ΔНт-Тау, респективно, што сугерише да је хетеротипска интеракција између αС и тау супериорнија од интеракције између тау молекула.између.
Интеракција са различитим поликатионима и ефекат процеса кондензације на кинетику αС прво су проучавани методом флуоресценције након фотобељења (ФРАП).Тестирали смо αС/Тау441, αС/ΔНт-Тау и αС/пЛК коацервате (100 μМ αС допуњен са 2 μМ αС АФ488-αС и 100 μМ Тау441 или ΔНт-Тау или 1 мМ пЛК).Подаци су добијени у првих 30 минута након мешања компоненти узорка.Из репрезентативних ФРАП слика (слика 3а, кондензација αС/Тау441) и њихових одговарајућих кривуља временског тока (слика 3б, додатна слика 3), може се видети да је кинетика αС веома слична оној код коацервата Тау441.и ΔНт-Тау, што је много брже са пЛК.Израчунати коефицијенти дифузије за αС унутар коацервата према ФРАП-у (како су описали Канг ет ал. 35) су Д = 0,013 ± 0,009 µм2/с и Д = 0,026 ± 0,008 µм2/с за αС/Тау-Сα4/Δ. αС/ систем.пЛК, Тау и Д = 0,18 ± 0,04 µм2/с, респективно (слика 3ц).Међутим, коефицијент дифузије αС у дисперзованој фази је неколико редова величине већи од свих кондензованих фаза, као што је утврђено флуоресцентном корелационом спектроскопијом (ФЦС, види додатну слику 3) под истим условима (ЛЛПС пуфер), али у одсуству поликатиона (Д = 8 ± 4 µм2/с).Због тога је кинетика транслације αС значајно смањена у коацерватима у поређењу са протеинима у диспергованој фази због изражених ефеката молекуларне гужве, иако сви коацервати задржавају својства слична течности током првих пола сата након формирања, за разлику од тау фазе.бржа кинетика у пЛК кондензату.
а–ц ФРАП анализа динамике αС (2% АФ488-обележеног αС) у електростатичким коацерватима.Репрезентативне слике αС/Тау441 ФРАП тестова у три примерка приказане су у (а), где црвени кругови означавају обезбојене области.Линија скале је 5 µм.б Просечне ФРАП криве и (ц) израчунати коефицијенти дифузије (Д) за 5–6 (Н) различитих капљица из три експеримента користећи 100 µМ αС и еквимоларне концентрације Тау441 (црвено) или ΔНт-Тау (плаво) или пЛК (зелено) у десет пута већој концентрацији од ЛЛПС.Стандардна девијација ФРАП криве је приказана осенченом бојом.За поређење, коефицијент дифузије αС у диспергованој фази одређен је у три примерка коришћењем флуоресцентне корелационе спектроскопије (ФЦС) (погледајте додатну слику 3 и методе за више информација).д Континуирани ЕПР спектри Кс-опсега од 100 μМ ТЕМПОЛ-122-αС у ЛЛПС пуферу без икакве поликације (црно) или у присуству 100 μМ Тау441 (црвено) или ΔНт-Тау (плаво) или 1 мМ пЛК (зелено).Уметак показује увећан приказ јаких линија поља где се дешавају најдраматичније промене.е Криве везивања 50 μМ ТЕМПОЛ-122-αС са различитим поликатионима у одсуству ЛЛПС (без ПЕГ).Показано је да смањена амплитуда опсега ИИИ у поређењу са опсегом ИИ (ИИИИ/ИИИ) нормализованог ЕПР спектра повећава моларне односе Тау441 (црвено), ΔНт-Тау (плаво) и пЛК (зелено).Обојене линије показују прилагођавање подацима користећи груби модел везивања са н идентичних и независних места везивања на свакој кривој.Необрађени подаци се пружају у облику датотека необрађених података.
Као допуну, истражили смо динамику αС у различитим коацерватима користећи усмерено спин обележавање (СДСЛ) и континуирану електронску парамагнетну резонанцу (ЦВ-ЕПР).Овај метод се показао веома корисним у извештавању о флексибилности и динамици ИРЛ са реалном резидуалном резолуцијом36,37,38.У ту сврху, конструисали смо остатке цистеина у појединачним Цис мутантима и користили спин сонду 4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-Н-оксил (ТЕМПОЛ).Деривати малеимида их означавају.Тачније, убацили смо ТЕМПОЛ сонде на позицију 122 или 24 αС (ТЕМПОЛ-122-αС и ТЕМПОЛ-24-αС).У првом случају циљамо на Ц-терминални регион протеина, који је укључен у интеракцију са поликатионима.Уместо тога, позиција 24 нам може дати информације о укупној динамици протеина у кондензату.У оба случаја, ЕПР сигнали добијени за протеине дисперговане фазе одговарали су нитроксидним радикалима у брзом покрету.Након одвајања фаза у присуству тау или пЛК (100 μМ ТЕМПОЛ-αС, Тау441 или ΔНт-Тау у односу 1:1 или пЛК у односу 1:10), уочено је повећање релативног интензитета пика у ЕПР спектар αС.Линија губитка се проширила, што указује на смањену кинетику преоријентације αС у капљицама у поређењу са протеином у разблаженој фази (слика 3д, додатна слика 4а).Ове промене су израженије на позицији 122. Док на позицији 24 присуство пЛК није утицало на кинетику сонде, на позицији 122 облик спектралне линије се значајно променио (допунска слика 4а).Када смо покушали да моделујемо спектре на позицији 122 два система αС/поликатион користећи изотропни модел (додатна слика 5а) који се обично користи за описивање динамике спин-обележеног ИДП38,39, нисмо били у могућности да реконструишемо експерименталне спектре..Спектрална симулација положаја контраста са 24 спина (додатна слика 5а).Ово сугерише да постоје преференцијалне позиције у простору спин конфигурација Ц-терминалног региона αС у присуству поликатиона.Када се узме у обзир удео αС у кондензованој фази под експерименталним ЕПР условима (84 ± 2%, 79 ± 7%, и 47 ± 4% за αС/Тау441, αС/ΔНт-Тау, и αС/пЛК, респективно—види Додатни Слика 2е анализе података ц), може се видети да проширење детектовано ЕПР методом углавном одражава интеракцију Ц-терминалног региона αС са различитим поликатионима у кондензованој фази (главна промена када се користи ТЕМПОЛ-122- αС), а не кондензација протеина.У сонди се примећује повећање микровискозности.Као што се очекивало, ЕПР спектар протеина у условима другачијим од ЛЛПС је потпуно обновљен када је 1 М НаЦл додат у смешу (додатна слика 4б).Све у свему, наши подаци сугеришу да промене откривене ЦВ-ЕПР углавном одражавају интеракцију Ц-терминалног региона αС са различитим поликатионима у кондензованој фази, а чини се да је ова интеракција јача са пЛК него са Тау.
Да бисмо добили више структурних информација о протеинима у коацервату, одлучили смо да проучавамо ЛЛПС систем користећи НМР у раствору.Међутим, могли смо да откријемо само αС фракцију која је остала у диспергованој фази, што може бити последица смањене динамике протеина унутар коацервата и густе фазе на дну раствора у НМР анализи.Када смо анализирали структуру и динамику протеина који је остао у диспергованој фази узорка ЛЛПС користећи НМР (додатна слика 5ц, д), приметили смо да се протеин понашао скоро идентично у присуству пЛК и ΔНт-Тау, оба које су биле у секундарној структури и динамици протеинске кичме, откривене експериментима на секундарном хемијском померању и релаксацији Р1ρ.НМР подаци показују да Ц-терминус αС трпи значајан губитак конформационе флексибилности док задржава своју неуређену природу, као и остатак секвенце протеина, због интеракције са поликатионима.
Пошто проширење ЦВ-ЕПР сигнала примећено у ТЕМПОЛ-122-αС кондензованој фази одражава интеракцију протеина са поликатионима, извршили смо ЕПР титрацију да проценимо афинитет везивања αС за различите поликатионе у одсуству ЛЛПС (без акумулације Пуфер ЛЛПС), што сугерише да су интеракције исте у разблаженим и концентрованим фазама (што потврђују наши подаци, Додатна слика 4а и Додатна слика 6).Циљ је био да се види да ли сви коацервати, упркос њиховим заједничким својствима сличним течности, показују било какво основно диференцијално понашање на молекуларном нивоу.Као што се очекивало, ЕПР спектар се проширио са повећањем концентрације поликатиона, што одражава смањење молекуларне флексибилности услед молекуларних интеракција свих партнера у интеракцији скоро до засићења (слика 3е, додатна слика 6).пЛК је постигао ову засићеност при нижем моларном односу (поликација:αС) у поређењу са ΔНт-Тау и Тау441.У ствари, поређење података са приближним моделом везивања уз претпоставку н идентичних и независних места везивања показало је да је привидна константа дисоцијације пЛК (~5 μМ) за ред величине нижа од оне код Тау441 или ΔНт-Тау (~50 μМ). ).µМ).Иако је ово груба процена, ово сугерише да αС има већи афинитет за једноставније поликације са континуираним регионима позитивног наелектрисања.С обзиром на ову разлику у афинитету између αС и различитих поликатиона, претпоставили смо да се њихова својства течности могу различито мењати током времена и стога патити од различитих ЛСПТ процеса.
С обзиром на веома претрпану средину унутар протеинског коацервата и амилоидну природу протеина, посматрали смо понашање коацервата током времена да бисмо открили могуће ЛСПТ процесе.Користећи БФ и ЦФ микроскопију (слика 4), приметили смо да αС/Тау441 коацервира у великој мери у раствору, формирајући велике капљице које додирују и влаже површину на дну бунара/клизача као пуне капљице, као што се очекивало (додатна слика 7д);ове структуре формиране дна називамо „протеинским сплавовима“.Ове структуре су остале течне јер су задржале способност спајања (додатна слика 7б) и могле су се видети неколико сати након што је ЛЛПС активиран (слика 4 и додатна слика 7ц).Приметили смо да је процес влажења фаворизован на површини хидрофилних, а не хидрофобних материјала (допунска слика 7а), као што се и очекивало за електростатичке коацервате са неуравнотеженим наелектрисањем и самим тим високим електростатичким површинским потенцијалима.Значајно је да су αС/ΔНт-Тау коалесценција и рафтинг значајно смањени, док су αС/пЛК кондензати значајно смањени (слика 4).Током кратког времена инкубације, αС/пЛК капљице су могле да се споје и навлаже хидрофилну површину, али овај процес је брзо заустављен и након 5 сати инкубације, примећени су само ограничени догађаји коалесценције и никакво влажење.– прелаз гел-кап.
Репрезентативни БФ (панели у сивим тоновима) и ЦФ (десни панели, αС означен са АФ488 зеленом бојом) узорака коацервата који садрже 100 µМ αС (1% флуоресцентне ознаке) у ЛЛПС пуферу у присуству 100 µМ Тау441 (горе) микроскопске слике ΔН флуоресценције -Тау (центар) или 1 мМ пЛК (дно) у различитим временима инкубације и фокусним висинама (з, растојање од дна бунарчића плоче).Експерименти су поновљени 4-6 пута независно један од другог са истим резултатима.Коацервати αС/Тау441 се навлаже након 24 сата, формирајући сплавове веће од слике.Скала за све слике је 20 µм.
Затим смо питали да ли би велики базени протеина налик течности формирани у αС / Тау441 ЛЛПС довели до агрегације амилоида било ког од проучаваних протеина.Пратили смо сазревање αС/Тау441 капљица током времена помоћу ВФ микроскопије под истим условима као горе, али користећи 1 μМ АФ488-обележене αС и Атто647Н-обележене Тау441 (слика 5а).Као што се очекивало, приметили смо потпуну локализацију протеина током процеса сазревања.Занимљиво, од ца.После 5 сати, уочене су интензивније некружне структуре унутар сплавова, које смо назвали „тачке“, од којих су неке колокализоване са αС, а неке обогаћене Тау441 (слика 5а, беле стрелице).Ове тачке су увек примећене унутар сплавова у већој мери за αС/ΔНт-Тау него за αС/ΔНт-Тау.Није било посебних тачака у капљицама пЛК и Тау система неспособних за фузију/квашење.Да бисмо тестирали да ли су ове мрље које садрже αС и Тау441 агрегати слични амилоиду, извели смо сличан експеримент користећи ЦФ микроскопију у којој је Тау441 обележен са Атто647Н и 12,5 μМ тиофлавин-Т (ТхТ) специфичног за амилоид додат је од почетка.дие.Иако ТхТ-бојење капљица или сплавова αС/Тау441 није примећено чак ни након 24 сата инкубације (слика 5б, горњи ред - преостале капљице преко протеинских сплавова), ТхТ-позитивне структуре које садрже Атто647Н-Тау441 унутар сплавова биле су веома слабе.ово реплицира величину, облик и локацију претходно описаних тачака (слика 5б, средњи и доњи редови), што сугерише да тачке могу одговарати агрегатима сличним амилоиду формираним у коацерватима течности за старење.
ВФ 25 μМ αС у различитим временима инкубације и фокусним висинама (з, растојање од невезаног дна) у присуству 25 μМ Тау441 (1 μМ αС обележеног АФ488 и Тау441 обележеног Атто647Н) у бунарчићу микроскопске плоче са ЛЛПС пуфером) .Шест експеримената је независно поновљено са сличним резултатима.б ЦФ микроскопска слика од 25 μМ αС у присуству 25 μМ Тау441 (1 μМ Атто647Н-обележеног Тау441) и 12,5 μМ тиофлавина-Т (ТхТ).Пондерисане протеинске капљице и депоноване протеинске сплавове и тачке приказане су у горњем и средњем реду, респективно.Доњи ред приказује слике сплавова и падова из 3 независне реплике.Беле стрелице означавају ТТ-позитивне тачке на оба панела.Скала за све слике је 20 µм.
Да бисмо детаљније испитали промене у мрежи протеина коацервата током преласка из течности у чврсту, користили смо флуоресцентно снимање животног века (ФЛИМ) и Форстер резонантну микроскопију преноса енергије (ФРЕТ) (слика 6 и додатне слике 8 и 9).Претпоставили смо да коацерватно сазревање слоја у више кондензовану или чак чврсту агрегирану структуру протеина доводи до ближег контакта између протеина и флуоресцентне сонде која је везана за њега, потенцијално стварајући ефекат гашења који се манифестује у скраћеном животном веку сонде (τ) , као што је претходно описано40.,41 ,42.Поред тога, за двоструко обележене узорке (АФ488 и Атто647Н као ФРЕТ донор и акцептор боје, респективно), ово смањење τ такође може бити праћено кондензацијом коацервата и повећањем ефикасности ФРЕТ(Е) током ЛСПТ.Пратили смо формирање сплава и тачака током времена у узорцима ЛЛПС αС/Тау441 и αС/ΔНт-Тау (25 µМ сваког протеина у ЛЛПС пуферу који садржи 1 µМ АФ488 обележен αС и/или Атто647Н обележен Тау441 или ΔНт-Тау).Приметили смо општи тренд да се животни век флуоресценције сонди АФ488 (τ488) и Атто647Н (τ647Н) благо смањио како су коацервати сазревали (слика 6 и додатна слика 8ц).Занимљиво је да је ова промена значајно побољшана за тачке унутар сплавова (слика 6ц), што указује да је дошло до даље кондензације протеина на тачкама.У прилог томе, није примећена значајна промена у животном веку флуоресценције за αС/ΔНт-Тау капљице старе 24 х (допунска слика 8д), што сугерише да је гелирање капљица процес који се разликује од уочавања и да није праћен значајном молекуларном реорганизацијом унутар коацервата.Треба напоменути да тачке имају различите величине и променљиви садржај у αС, посебно за систем αС / Тау441 (додатна слика 8е).Смањење животног века флуоресценције тачке праћено је повећањем интензитета, посебно за Атто647Н означен Тау441 (додатна слика 8а), и већом ефикасношћу ФРЕТ за αС/Тау441 и αС/ΔНт-Тау системе, што указује на даље кондензације ЛЛПС-а. након активирања, протеини унутар статичког електрицитета су се кондензовали.У поређењу са αС/ΔНт-Тау, приметили смо ниже вредности τ647Н и нешто веће вредности τ488 у αС/Тау441 тачкама, праћене нижим и нехомогеним вредностима ФРЕТ.Вероватно, ово може бити повезано са чињеницом да је у систему αС/Тау441 уочено и очекивано обиље αС у агрегатима хетерогеније, често субстехиометријско у поређењу са Тау, пошто сам Тау441 такође може проћи кроз ЛЛПС и агрегацију (додатна слика 8е) .Међутим, степен коалесценције капљица, формирање сплава и, што је важно, агрегација протеина унутар коацервата сличних течности је максималан када су присутни и Тау441 и αС.
доживотна флуоресцентна микроскопија (ФЛИМ) слике αС/Тау441 и αС/ΔНт-Тау на 25 μМ сваког протеина (1 μМ αС обележен АФ488 и 1 μМ Тау441 обележен Атто647Н или ΔНт-Тау пуфер) у.Колоне показују репрезентативне слике узорака ЛЛПС у различитим временима сазревања (30 мин, 5 х и 24 х).Црвени оквир приказује регион који садржи αС/Тау441 тачке.Животни век је приказан као траке у боји.Скала трака = 20 µм за све слике.б Увећана ФЛИМ слика изабране области, приказана у црвеном пољу на панелу а.Опсези трајања су приказани користећи исту скалу боја као на панелу а.Скала бар = 5 µм.ц Хистограми који приказују АФ488 (везан за αС) или Атто647Н (везан за Тау) за различите врсте протеина (капљице-Д-, сплав-Р- и спекле-П) идентификоване на ФЛИМ сликама снимљеним за αС-) временске дистрибуције животног века Тау441 и Узорци коацервата αС/ΔНт-Тау (Н = 17-32 РОИ за Д, 29-44 РОИ за Р и 21-51 РОИ за тачке).Средње и средње вредности су приказане као жути квадрати и црне линије унутар оквира, респективно.Доња и горња граница оквира представљају први и трећи квартил, респективно, а минималне и максималне вредности унутар 1,5-струког интерквартилног опсега (ИКР) су приказане као бркови.Изрази су приказани као црни дијаманти.Статистичка значајност између парова дистрибуција је одређена коришћењем т-теста са два узорка, уз претпоставку неједнаких варијанси.Двостране п-вредности т-теста су приказане звездицама за сваки пар упоређених података (* п-вредност > 0,01, ** п-вредност > 0,001, *** п-вредност > 0,0001, **** п-вредност > 0,00001), нс Указује на занемарљивост (п-вредност > 0,05).Тачне п вредности су дате у Додатној табели 1, а оригинални подаци су представљени као датотеке сирових података.
Да бисмо даље демонстрирали природу тачкица/агрегата налик амилоиду, третирали смо необојене узорке коацервата током 24 сата са високим концентрацијама (1 М) НаЦл, што је резултирало одвајањем агрегата од протеинских коацервата.Када су изоловани агрегати (тј. дисперговани раствор агрегата) примећени помоћу микроскопије атомске силе (АФМ), приметили смо претежно сферичну морфологију са правилном висином од око 15 нм, која има тенденцију да се повезује у условима високе концентрације соли, слично понашање типичних амилоидних фибрила због снажног хидрофобног ефекта на површини (имајте на уму да фибрили обично имају висину од ~10 нм) (додатна слика 10а).Занимљиво је да када су изоловани агрегати инкубирани са ТхТ у стандардном тесту флуоресценције ТхТ, приметили смо драматично повећање квантног приноса флуоресценције ТхТ, упоредиво са оним уоченим када је боја инкубирана са типичним αС амилоидним фибрилима (додатна слика, што сугерише да је слика 10б). коацерватни агрегати садрже структуре сличне амилоиду..У ствари, агрегати су били толерантни на високе концентрације соли, али осетљиви на 4 М гванидин хлорид (ГднХЦл), попут типичних амилоидних фибрила (додатна слика 10ц).
Затим смо анализирали састав агрегата коришћењем флуоресценције једног молекула, специфичне флуоресцентне корелације/унакрсне корелационе спектроскопије (ФЦС/ФЦЦС) и рафалне анализе детекције двобојних коинциденција (ТЦЦД).У ту сврху, изоловали смо агрегате формиране након 24 сата инкубације у узорцима од 100 μл ЛЛПС који садрже αС и Тау441 (оба 25 μМ) заједно са 1 μМ АФ488 обележеним αС и 1 μМ Атто647Н обележеним Тау441.Разблажите добијени раствор диспергованог агрегата до мономолекуларног стања користећи исти пуфер без ПЕГ и 1 М НаЦл (исти пуфер који се користи за одвајање агрегата од коацервата) да бисте спречили све могуће електростатичке интеракције између ЛЛПС и протеина.Пример временске путање једног молекула може се видети на слици 7а.ФЦЦС/ФЦС анализа (унакрсна корелација, ЦЦ и аутокорелација, АЦ) је показала да су агрегати који садрже αС и тау били у изобиљу у узорцима (видети ЦЦ криву на слици 7б, леви панел), а вишак резидуалног мономерног протеина је настао као резултат процеса разблаживања (погледајте АЦ криве на слици 7б, леви панел).Контролни експерименти изведени под истим условима раствора коришћењем узорака који садрже само мономерне протеине нису показали ЦЦ криве, а АЦ криве се добро уклапају са једнокомпонентним моделом дифузије (једначина 4), где мономерни протеини имају очекиване коефицијенте дифузије (слика 7б). ), десни панел).Коефицијент дифузије агрегираних честица је мањи од 1 µм2/с, а мономерних протеина око 1 µм2/с.50–100 µм/с;вредности су сличне претходно објављеним вредностима за сонициране αС амилоидне фибриле и мономерни αС одвојено под сличним условима раствора44.Када смо анализирали агрегате ТЦЦД анализом експлозије (слика 7ц, горњи панел), открили смо да у сваком изолованом агрегату (αС/Тау хетероагрегат), око 60% откривених агрегата садржи и αС и тау, око 30% садржи само тау, око 10% само αС.Стехиометријска анализа αС/Тау хетероагрегата је показала да је већина хетероагрегата обогаћена тау (стехиометрија испод 0,5, просечан број тау молекула по агрегату је 4 пута већи од αС молекула), што је у складу са нашим радом уоченим у ФЛИМ ин ситу експерименти..ФРЕТ анализа је показала да ови агрегати садрже оба протеина, иако стварне вредности ФРЕТ у овом случају нису од велике важности, пошто је расподела флуорофора у сваком агрегату била насумична због вишка необележеног протеина коришћеног у експерименту.Занимљиво је да када смо извршили исту анализу користећи 45,46 зрелу амилоидну агрегацију са недостатком Тау варијанте (погледајте додатну слику 11а, б), приметили смо да иако је αС електростатичка агрегација била иста (додатна слика 11ц, д), способност формирања агрегата унутар коацервата је драстично смањена и ФЛИМ је открио неколико тачака у ин ситу експериментима, а уочене су слабе криве унакрсне корелације за изоловане узорке агрегата.Међутим, за мали број откривених агрегата (само једна десетина Тау441), приметили смо да је сваки агрегат обогаћен αС од ове Тау варијанте, при чему је приближно 50% откривених агрегата садржало само αС молекуле, а αС је био хетероген у вишку. .агрегати (види додатну слику 11е), за разлику од хетерогених агрегата које генерише Тау441 (слика 6ф).Резултати ових експеримената су показали да иако је сам αС способан да се акумулира са тау унутар коацервата, тау нуклеација је повољнија под овим условима, а резултујући агрегати слични амилоиду могу да делују као облик αС и тау.Међутим, када се формира језгро богато тау, хетеротипске интеракције између αС и тау су фаворизоване у агрегатима у односу на хомотипске интеракције између тау молекула;такође посматрамо протеинске мреже у течним αС/тау коацерватима.
а Репрезентативни временски трагови флуоресценције појединачних молекула изолованих агрегата формираних у αС/Тау441 електростатичким коацерватима.Рафали који одговарају коагрегатима αС/Тау441 (рафали изнад назначеног прага) примећени су у три канала детекције (емисија АФ488 и Атто647Н након директног побуђивања, плаве и црвене линије, Атто647Н емисија након индиректне ексцитације), ФРЕТ, љубичаста линија).б ФЦС/ФЦЦС анализа узорка изолованих αС/Тау441 агрегата добијених из ЛЛПС (лева табла).Криве аутокорелације (АЦ) за АФ488 и Атто647Н су приказане плавом и црвеном бојом, а криве унакрсне корелације (ЦЦ) повезане са агрегатима који садрже обе боје приказане су љубичастом бојом.АЦ криве одражавају присуство обележених мономерних и агрегираних протеинских врста, док ЦЦ криве показују само дифузију двоструко обележених агрегата.Иста анализа, али под истим условима раствора као на изолованим местима, узорци који садрже само мономерни αС и Тау441 приказани су као контроле на десном панелу.ц Флуоресцентна флеш анализа појединачних молекула изолованих агрегата формираних у αС/Тау441 електростатичким коацерватима.Информације за сваки агрегат пронађен у четири различита понављања (Н = 152) су приказане у односу на њихову стехиометрију, С вредности и ФРЕТ ефикасност (горњи панел, трака у боји одражава појаву).Могу се разликовати три типа агрегата: -αС-само агрегати са С~1 и ФРЕТ~0, агрегати само Тау са С~0 и ФРЕТ~1, и хетерогени Тау/αС агрегати са средњим С и ФРЕТ Процене количине оба маркерска протеина откривена у сваком хетерогеном агрегату (Н = 100) су приказана на доњем панелу (скала боја одражава појаву).Необрађени подаци се пружају у облику датотека необрађених података.
Сазревање или старење течних протеинских кондензата у геласте или чврсте структуре током времена је пријављено да је укључено у неколико физиолошких функција кондензата47 као иу болести, као абнормални процес који претходи агрегацији амилоида 7, 48, 49. Овде детаљно проучавамо фазно раздвајање и понашање.ЛСПТ αС у присуству насумичних поликатиона у контролисаном окружењу при ниским микромоларним концентрацијама и физиолошки релевантним условима (имајте на уму да је израчуната физиолошка концентрација αС >1 µМ50), пратећи типично термодинамички вођено понашање ЛПС.Открили смо да αС, који садржи високо негативно наелектрисан Ц-терминални регион при физиолошком пХ, може да формира капљице богате протеинима у воденом раствору преко ЛЛПС у присуству високо катјонских поремећених пептида као што су пЛК или Тау кроз процес електростатичке комплексна кондензација у присуству агрегационих макромолекула.Овај процес може имати релевантне ефекте у ћелијском окружењу где αС наилази на различите поликатионске молекуле повезане са његовом агрегацијом повезаном са болешћу и ин витро и ин виво51,52,53,54.
У многим студијама, динамика протеина унутар капљица се сматра једним од кључних фактора који одређују процес сазревања55,56.У електростатичким αС коацерватима са поликатионима, процес сазревања очигледно зависи од јачине интеракције са поликатионима, валенце и вишеструкости ових интеракција.Теорија равнотеже сугерише да би равнотежни пејзаж два течна стања био присуство велике капљице богате биополимерима који покрећу ЛЛПС57,58.Раст капљица се може постићи Оствалдовим сазревањем59, коалесценцијом60 или потрошњом слободног мономера у дисперзованој фази61.За αС и Тау441, ΔНт-Тау или пЛК, већина протеина је концентрисана у кондензату под условима коришћеним у овој студији.Међутим, док су се тау капљице пуне величине брзо спајале након површинског влажења, спајање и влажење капљица су били тешки за ΔНт-Тау и пЛК, што указује на брз губитак својстава течности у ова два система.Према нашој ФЛИМ-ФРЕТ анализи, остареле пЛК и ΔНт-Тау капљице показале су сличан степен агрегације протеина (сличан животни век флуоресценције) као оригиналне капљице, што сугерише да је оригинална протеинска мрежа задржана, иако чвршћа.
Ми рационализујемо наше експерименталне резултате у следећем моделу (слика 8).Првобитно привремено формиране капљице су често протеинске мреже без електростатичке компензације, па стога постоје области неравнотеже наелектрисања, посебно на интерфејсу капљица, што резултира капљицама са високим електростатичким површинским потенцијалом.Да би се компензовао набој (феномен који се обично назива смањењем валенције) и минимизирао површински потенцијал капљица, капљице могу укључити нове полипептиде из разблажене фазе, реорганизовати мреже протеина ради оптимизације интеракција наелектрисања и наелектрисања и интеракције са другим капљицама.са површинама (квашење).Капљице αС/пЛК, због своје једноставније протеинске мреже (само хетеротипске интеракције између αС и пЛК) и већег афинитета за интеракције протеин-протеин, изгледа да могу брже да избалансирају наелектрисање кондензата;заиста, приметили смо бржу кинетику протеина у првобитно формираним αС/пЛК коацерватима него у αС/Тау.Након исцрпљивања валенције, интеракције постају мање ефемерне и капљице губе своја течна својства и претварају се у гелове, незапаљиве капљице са ниским електростатичким површинским потенцијалом (и стога не могу да навлаже површину).Насупрот томе, αС/Тау капљице су мање ефикасне у оптимизацији баланса наелектрисања капљица због сложенијих протеинских мрежа (са хомотипским и хетеротипским интеракцијама) и слабије природе интеракција протеина.Ово резултира капљицама које задржавају понашање течности током дужег временског периода и показују висок електростатички површински потенцијал који има тенденцију да се минимизира спајањем и растом (чиме се минимизира однос површина/запремина капљица) и влажењем хидрофилне површинске хемикалије.Ово ствара велике концентрисане библиотеке протеина које задржавају својства течности јер интеракције остају веома пролазне због сталне потраге за оптимизацијом наелектрисања у мрежи протеина.Занимљиво је да Н-терминално скраћени облици Тау, укључујући неке природне изоформе62, показују средње понашање, при чему неки коацервати старе са αС у дуговечне капљице сличне гелу, док се други претварају у велике течне кондензате.Ова дуалност у сазревању αС електростатичких коацервата је у складу са недавним теоријским и експерименталним студијама ЛЛПС-а које су идентификовале корелацију између исцрпљивања валенције и електростатичког просејавања у кондензатима као кључа за контролу величине кондензата и својстава течности.Механизам 58.61.
Ова шема приказује претпостављени пут агрегације амилоида за αС и Тау441 преко ЛЛПС и ЛСПТ.Са додатним ањонима богатим (црвени) и катјонима (плави) региони, αС и тау електростатички коацервати са задовољавајућом валентношћу имају нижу површинску енергију и стога мању коалесценцију, што доводи до брзог старења капљица.Постиже се стабилно неагломерирано стање гела..Ова ситуација је веома повољна у случају αС/пЛК система због његовог већег афинитета и једноставније мреже интеракције протеин-пар, што омогућава брзу транзицију налик гелу.Напротив, капљице са незадовољавајућом валентношћу и, према томе, региони напуњени протеинима доступни за интеракцију, олакшавају коацервату да се стопи и навлажи хидрофилну површину како би се смањила његова висока површинска енергија.Ова ситуација је пожељнија за αС/Тау441 коацервате, који имају мултивалентну комплексну мрежу која се састоји од слабих Тау-Тау и αС-Тау интеракција.Заузврат, већи коацервати ће лакше задржати своја својства налик течности, омогућавајући да се догоде друге интеракције протеин-протеин.На крају, амилоидни хетерогени агрегати који садрже и αС и тау формирају се унутар течности коацервата, што може бити повезано са онима који се налазе у инклузијским телима, која су обележја неуродегенеративних болести.
Велике структуре сличне течности формиране током сазревања αС/Тау441 са веома загушеним, али динамичним протеинским окружењем и, у мањој мери, коацерватима αС/ΔНт-Тау идеални су резервоари за нуклеацију агрегације протеина.Заиста смо приметили формирање чврстих протеинских агрегата у овој врсти протеинских коацервата, који често садрже и αС и тау.Показали смо да су ови хетероагрегати стабилизовани неелектростатичким интеракцијама, да су у стању да вежу амилоидне специфичне ТхТ боје на исти начин као типичне амилоидне фибриле и заиста имају сличну отпорност на различите утицаје.Показало се да αС/тау агрегати формирани од ЛЛПС-а имају својства слична амилоиду.Заиста, зрела варијанта Тау са недостатком амилоидне агрегације је значајно оштећена у формирању ових хетерогених αС агрегата унутар течног електростатичког коацервата.Формирање αС/Тау441 агрегата примећено је само унутар коацервата, који су задржали својства слична течности, и никада, ако коацервати/капљице нису достигли стање гела.У последњем случају, повећана снага електростатичких интеракција и, као резултат тога, ригидност протеинске мреже спречавају неопходна конформациона преуређивања протеина за успостављање нових интеракција протеина неопходних за нуклеацију амилоида.Међутим, ово се може постићи у флексибилнијим, течним коацерватима, за које је већа вероватноћа да ће остати течни како се повећавају.
Чињеница да је формирање агрегата унутар кондензоване фазе пожељно у великим αС/Тау кондензатима него у малим капљицама које се брзо гелирају, наглашава важност идентификације фактора који контролишу коалесценцију капљица.Дакле, не само да постоји тенденција раздвајања фаза, већ се и величина кондензата мора контролисати ради правилног функционисања, као и превенције болести58,61.Наши резултати такође наглашавају важност равнотеже између ЛЛПС и ЛСПТ за αС/Тау систем.Док формирање капљица може заштитити од агрегације амилоида смањењем количине протеинских мономера доступних у условима засићења, као што је предложено у другим системима63,64, фузија капљица на високим нивоима капљица може довести до унутрашње агрегације протеина кроз спора конформациона преуређивања.протеинске мреже..
Све у свему, наши подаци снажно наглашавају релевантност кохезивне валенције и задовољних/незадовољних интеракција у мрежама пада у контексту ЛСПТ.Конкретно, показујемо да су кондензати αС/Тау441 пуне дужине у стању да се ефикасно спајају и стварају језгру како би формирали хетероагрегате сличне амилоиду који укључују оба протеина и предлажу молекуларни механизам заснован на нашим експерименталним резултатима.Коагрегација два протеина у коацервату αС/Тау течности о којој овде извештавамо може заиста бити повезана са ко-локализацијом два протеина у инклузијама, који су обележја болести, и могу допринети разумевању односа између ЛЛПС и агрегација амилоида, утирући пут високо набијеном ИДП-у у неуродегенерацији.
Мономерни ВТ-αС, цистеински мутанти (К24Ц-αС, Н122Ц-αС) и ΔЦт-αС варијанте (Δ101-140) су експримирани у Е. цоли и пречишћени као што је претходно описано.5 мМ ДТТ је укључен у све кораке у пречишћавању αС цистеинских мутаната да би се спречило формирање дисулфидне везе.Тау441 изоформа (плазмид добијен из Аддгене #16316), ΔНт-Тау варијанта (Δ1–150, добијен клонирањем ИВА са прајмерима ЦТТТААГААГГАГАТАЦАТАТГАТЦГЦЦАЦАЦЦГЦГГ, ЦАТАТГТАТАТЦЦТЦТЦТТЦТТАААГТТАААЦ-Тау1ЦТДАЦ пурифиед ΔТау1ЦТДАЦ са пурификованим 5 прајмера) Е. цоли културе су биле нарастао до ОД600 = 0,6–0,7 на 37°Ц и 180 о/мин, а експресија је индукована са ИПТГ током 3 сата на 37°Ц.Сакупите ћелије на 11.500 кг током 15 минута на 4 °Ц и исперите физиолошким пуфером који садржи 150 мМ НаЦл.Ресуспендујте пелет у пуферу за лизу (20 мл по 1 Л ЛБ: МЕС 20 мМ, пХ 6,8, НаЦл 500 мМ, ЕДТА 1 мМ, МгЦл2 0,2 ​​мМ, ДТТ 5 мМ, ПМСФ 1 мМ, μМ1, 50 μптин мМ0).Корак соникације је изведен на леду са амплитудом од 80% за 10 импулса (1 мин укључен, 1 мин искључен).Не прелази 60 мл у једном ултразвуку.Лизати Е. цоли су загревани на 95°Ц током 20 минута, затим охлађени на леду и центрифугирани на 127,000×г током 40 минута.Пречишћени супернатант је нанесен на мембрану од 3,5 кДа (Спецтрум™ Тхермо Фисхер Сциентифиц, УК) и дијализиран је против 4 Л пуфера за дијализу (20 мМ МЕС, пХ 6,8, НаЦл 50 мМ, ЕДТА 1 мМ, МгЦл2 ДТТ 2 мМ , ПМСФ 0,1 мМ) током 10 сати.Колона од 5 мл катјона (ХиТрап СПФФ, Цитива, МА, САД) је еквилибрисана пуфером за равнотежу (20 мМ МЕС, пХ 6,8, 50 мМ НаЦл, 1 мМ ЕДТА, 2 мМ МгЦл2, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ ДТТ, 0,1).Тау лизат је филтриран кроз 0,22 μм ПВДФ филтер и убризган у колону брзином протока од 1 мл/мин.Елуирање је вршено постепено, тау је елуиран са 15–30% пуфера за елуирање (20 мМ МЕС, пХ 6,8, 1 М НаЦл, 1 мМ ЕДТА, 2 мМ МгЦл2, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ ПМСФ).Фракције су анализиране помоћу СДС-ПАГЕ, а све фракције које садрже једну траку са очекиваном молекулском тежином тау су концентрисане коришћењем 10 кДа центрифугалног филтера и замењене пуфером који садржи 10 мМ ХЕПЕС, пХ 7,4, НаЦл 500 мМ и ДТТ 2 мМ за коначна концентрација протеина била је 100 μМ.Раствор протеина је затим пропуштен кроз 0,22 μм ПВДФ филтер, брзо замрзнут и чуван на -80°Ц.Протеин К18 је љубазно обезбедио проф. Алберто Бофи.Чистоћа препарата је била >95%, што је потврђено СДС-ПАГЕ и МАЛДИ-ТОФ/ТОФ.Различити цистеини су хемијски обележени АлекаФлуор488-малеимидом (АФ488, ТхермоФисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД) или ТЕМПОЛ-малеимидом (Торонто Ресеарцх Цхемицалс, Торонто, Канада).су потврђени апсорбанцијом и МАЛДИ-ТОФ/ТОФ.Тау441, ΔНт-Тау, АггДеф-Тау и К18 су обележени нативним остацима цистеина на позицијама 191 и 322 коришћењем Атто647Н-малеимида (АТТО-ТЕЦ ГмбХ, Сиеген, Немачка) по истој процедури.Мапе нето наплате по остатку за αС и Тау441 су генерисане коришћењем ЦИДЕР66.
Чврсти поли-Л-лизин (пЛК ДП 90-110 према НМР од добављача, Аламанда Полимерс Инц, Хунтсвилле, Алабама, САД) растворен је у 10 мМ ХЕПЕС, 100 мМ НаЦл, пХ 7,4 до 10 мМ концентрацији 5, процес обрађен ултразвуком минута у ултразвучном воденом купатилу и чувати на -20°Ц.ПЕГ-8, декстран-70, ФИТЦ-ПЕГ-10 (Биоцхемпег, Ватертовн, МА, САД) и ФИТЦ-декстран-500 (Сигма-Алдрицх, Сант Лоуис, МИ, УСА) су растворљиви у води и широко распрострањени у ЛЛПС пуферу.Дијализом се уклањају контаминирајуће соли.Затим су филтрирани кроз шприц филтер са величином пора од 0,22 μм, а њихове концентрације су израчунате помоћу рефрактометра (Меттлер Толедо, Цолумбус, Охајо, САД).ЛЛПС узорци су припремљени на собној температури следећим редоследом: пуфер и екструзија су помешани и 1 мМ трис(2-карбоксиетил)фосфин (ТЦЕП, Царбосинтх, Цомптон, УК), 1 мМ 2,2,2,2-(етан- 1,2-диилдинитрил) тетрасирћетне киселине (ЕДТА, карбоксинт) и мешавине 1% инхибитора протеазе (ПМСФ 100 мМ, бензимид 1 мМ, леупептин 5 μМ).Затим се додају αС и фузионисани поликатиони (опције пЛК или Тау).За експерименте са временским серијама тиофлавина-Т (ТхТ, Царбосинтх, Цомптон, УК), користите укупну концентрацију ТхТ да буде половина концентрације αС.Нежно, али темељно промешајте узорке како бисте били сигурни да су хомогени.Концентрација сваке компоненте је варирала од експеримента до експеримента, као што је описано у одељку Резултати.Азид је коришћен у концентрацији од 0,02% (в/в) кад год је трајање експеримента прелазило 4 сата.За све анализе које користе ЛЛПС узорке, оставите смешу да се уравнотежи 5 минута пре анализе.За анализу расејања светлости, 150 µл узорака је стављено на невезујуће микроплоче са 96 јажица (µЦлеар®, црне, Ф-Боттом/Цхимнеи Велл, Греинер био-оне, Кремсминстер, Аустрија) и прекривене лепљивим филмом.ЛЛП су праћени мерењем апсорбанције на 350 нм у центру раствора у ЦЛАРИОстар читачу плоча (БМГ Лабтецх, Ортенберг, Немачка).Експерименти су изведени у три примерка на 25°Ц, а грешке су израчунате као стандардна девијација од средње вредности.Разређена фаза је квантификована центрифугирањем узорка и СДС-ПАГЕ гел анализом, а αС фракција у разблаженој и концентрованој фази је квантификована у различитим растворима ЛЛПС.Узорак ЛЛПС од 100 μл који садржи 1 μМ αС обележеног АФ488 припремљен је темељним мешањем након чега је уследило центрифугирање на 9600 × г током 30 минута, након чега је талог обично био видљив.Горњих 50 μл супернатанта је коришћено за квантификацију протеина коришћењем СДС-ПАГЕ гела.Гелови су скенирани АФ488 филтерима коришћењем ЦхемиДоц система за снимање гела (Био-Рад Лабораториес, Херцулес, Калифорнија, САД) или обојени Цоомассие бојом и визуелизовани одговарајућим филтерима.Добијене траке су анализиране коришћењем ИмагеЈ верзије 1.53и (Национални институти за здравље, САД).Експерименти су изведени у дупликату у два различита експеримента са сличним резултатима.
Типично, 150 μл узорака је примењено на невезујуће микроплоче са 96 јажица и визуелизовано на собној температури на Леица ДМИ6000Б инвертованом микроскопу (Леица Мицросистемс, Ветзлар, Немачка).За спот експерименте, такође су коришћене µ-Слиде Ангиогенесис плоче (Ибиди ГмбХ, Графелфинг, Немачка) или полистиренске микроплоче са 96 јажица (Цорнинг Цостар Цорп., Ацтон, Массацхусеттс).ЕЛ6000 халогене или живине метал-халогене сијалице су коришћене као извори осветљења (за БФ/ДИЦ и ВФ снимање, респективно).За ВФ микроскопију, коришћен је ваздушни објектив са увећањем од 40к (Леица Мицросистемс, Немачка) за фокусирање светлости на узорак и његово прикупљање.За узорке означене са АФ488 и ТхТ, побуђивање и емисија филтера са стандардним ГФП филтерима, ексцитационим и емисионим пропусним филтерима, респективно, 460–500 нм и 512–542 нм пропусним филтерима и дихроичним огледалом од 495 нм.За узорке означене са Атто647Н, коришћен је стандардни сет Ци5 филтера са ексцитационим и емисионим пропусним филтерима 628–40 нм и 692–40 нм, респективно, и 660 нм дихроично огледало.За БФ и ДИЦ микроскопију користите исти објектив за сакупљање рефлектованог светла.Прикупљена светлост је снимљена на Леица ДФЦ7000 ЦЦД камери (Леица Мицросистемс, Немачка).Време експозиције је било 50 мс за БФ и ДИЦ микроскопско снимање и 20-100 мс за ВФ микроскопско снимање.Поређења ради, време експозиције за све експерименте са ТхТ било је 100 мс.Експерименти са временским одмаком су изведени да би се визуелизовала коалесценција капљица, при чему су слике сакупљане сваких 100 мс током неколико минута.ИмагеЈ (НИХ, САД) је коришћен за анализу слике.Експерименти су изведени у три примерка са сличним резултатима.
За експерименте колокализације, ФРАП и 3Д реконструкцију, слике су добијене на Зеисс ЛСМ 880 инвертованом конфокалном микроскопу коришћењем ЗЕН 2 плавог издања (Царл Зеисс АГ, Оберкоцхен, Немачка).Узорци од 50 µл су примењени на µ-Слиде Ангиогенесис Петријеве посуде (Ибиди ГмбХ, Грофелфинг, Немачка), третиране хидрофилним полимером (ибиТреат) и постављене у 63× имерзиони објектив (План-Апоцхромат 63×/НА 1,4 Оил) на ДИЦ).Слике су добијене коришћењем аргон ласерских линија од 458 нм, 488 нм и 633 нм са резолуцијом од 0,26 µм/пиксел и временом експозиције од 8 µс/пиксел за прозоре ексцитације и детекције емисије од 470-600 нм, 493-62 нм. и 638–755 нм је коришћен за визуелизацију ТхТ, АФ488 и Атто647Н, респективно.За ФРАП експерименте, тиме-лапсе фотографија сваког узорка је снимљена при 1 кадру у секунди.Експерименти су изведени у три примерка на собној температури са сличним резултатима.Све слике су анализиране коришћењем софтвера Зен 2 блуе едитион (Царл Зеисс АГ, Оберкоцхен, Немачка).ФРАП криве су нормализоване, уцртане и прилагођене подацима о интензитету/времену екстрахованим из слика коришћењем Зен 2 користећи ОригинПро 9.1.Криве опоравка су прилагођене моно-експоненцијалном моделу да би се узела у обзир молекуларна дифузија са додатним експоненцијалним термином да би се урачунао ефекат бељења аквизиције.Затим смо израчунали Д користећи номинални радијус избељивања и претходно одређено време полураспада опоравка као у једначини Канг ет ал.5 35 приказано.
Појединачне цистеинске варијанте αС су синтетизоване са 4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-Н-оксилом (ТЕМПОЛ) на позицијама 24 (ТЕМПОЛ-24-αС) и 122 (ТЕМПОЛ-122-αС), редом.Обележавање спином За ЕПР експерименте, концентрација αС је постављена на 100 μМ, а концентрација ПЕГ-а је била 15% (в/в).За различите услове агрегације, однос αС:пЛК је био 1:10, док су односи αС:ΔНт-Тау и αС:Тау441 одржавани на 1:1.За експерименте са титрацијом везивања у одсуству гужве, ТЕМПОЛ-122-αС је одржаван на 50 μМ, а поликатиони су титрирани у растућим концентрацијама, припремајући сваки услов посебно.ЦВ-ЕПР мерења су спроведена коришћењем Брукер ЕЛЕКССИС Е580 Кс-банд спектрометра опремљеног Брукер ЕР4118 СПТ-Н1 резонатором који ради на микроталасној (СХФ) фреквенцији од ~9,7 ГХз.Температура је подешена на 25°Ц и контролисана криостатом са течним азотом.Спектри су добијени у незасићеним условима при МВ снази од 4 мВ, амплитуди модулације од 0,1 мТ и фреквенцији модулације од 100 кХз.Спектрални интензитети су нормализовани да би се избегле разлике у концентрацијама спина између узорака и могуће смањење спина због резидуалних концентрација редукционих агенаса у узорцима који садрже Тау441 или ΔНт-Тау (присутан у оригиналним растворима протеина).Задате вредности г добијене су као резултат ЕПР спектралног моделирања извршеног коришћењем Еасиспин софтвера (в. 6.0.0-дев.34) имплементираног у Матлаб®67.За моделирање података коришћени су једнокомпонентни/двокомпонентни изотропни модели.Након нормализације свих сигнала, резидуали су израчунати одузимањем сваке симулације од одговарајућег експерименталног спектра.За анализу титрације везивања, релативни интензитет трећег и другог опсега нормализованог ЕПР спектра (ИИИИ/ИИИ) је коришћен за праћење везивања поликатиона за αС.Да би се проценила константа дисоцијације (Кд), резултујућа крива је прилагођена приближном моделу уз претпоставку н идентичних и независних места везивања.
Експерименти НМР спектроскопије су изведени коришћењем Брукер Нео 800 МХз (1Х) НМР спектрометра опремљеног криосондом и З-градијентом.Сви експерименти су изведени коришћењем 130–207 µМ αС и одговарајућих αС/ΔНт-Тау и пЛК еквивалената у 10 мМ ХЕПЕС, 100 мМ НаЦл, 10% ДО, пХ 7,4 и изведени су на 15°Ц.За праћење ЛПС помоћу НМР, 10% ПЕГ је додато у претходно помешане узорке.Графикон пертурбације хемијског померања (слика 1б) показује просечне 1Х и 15Н хемијске помаке.αС 2Д1Х-15Н ХСКЦ спектри су додељени на основу претходног додељивања (БМРБ унос #25227) и потврђени снимањем и анализом 3Д спектра ХНЦА, ХНЦО и ЦБЦАцоНХ.Хемијски помаци 13Цα и 13Цβ су израчунати у присуству ΔНт-Тау или пЛК да би се измериле могуће промене у трендовима секундарне структуре у поређењу са αС хемијским помацима у чисто случајној конформацији завојнице 68 (додатна слика 5ц).Брзине Р1ρ су мерене снимањем експеримената хскцтретф3гпси (добијених из Брукерове библиотеке) са кашњењима од 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 и 800 мс, а експоненцијалне функције су прилагођене за кашњење вршног интензитета на пута за одређивање Р1ρ и његове експерименталне несигурности.
Експерименти са флуоресцентном микроскопијом у две боје са временским разлучивањем су изведени на комерцијалном МТ200 флуоресцентном конфокалном микроскопу са временским резолуцијом (ПицоКуант, Берлин, Немачка) са временски корелираним уређајем за бројање појединачних фотона (ТЦСПЦ).Глава ласерске диоде се користи за импулсно интерлеавед екцитатион (ПИЕ), сноп пролази кроз једномодни таласовод и подешава се на снагу ласера ​​од 10 до 100 нВ за ласерске линије од 481 нм и 637 нм мерене након дихроичног огледала.Ово осигурава оптималну стопу бројања фотона, избегавајући ефекте фотона псећења, фотобељења и засићења.Поклопци или плоче за ангиогенезу μ-Слиде (Ибиди ГмбХ, Грефелфинг, Немачка) стављене су директно у воду за потапање преко Супер Апоцхромат 60к НА 1.2 сочива са корективном крагном (Олимпус Лифе Сциенцес, Валтхам, САД).Као главни разделник снопа коришћено је дихроично огледало од 488/640 нм (Семроцк, Лаке Форест, ИЛ, САД).Нефокусирано зрачење је блокирано рупом пречника 50 микрона, а затим се фокусирано зрачење дели на 2 путање детекције помоћу разделника снопа 50/50.Испред детектора су коришћени емисиони филтери опсега (Семроцк, Лаке Форест, ИЛ, УСА) 520/35 за зелену боју (АФ488) и 690/70 за црвену боју (Атто647Н).Као детектори коришћене су једнофотонске лавинске диоде (СПАД) (Мицро Пхотон Девицес, Болцано, Италија).И прикупљање података и анализа обављени су коришћењем комерцијално доступног софтвера СимпхоТиме64 (ПицоКуант ГмбХ, Берлин, Немачка).
Педесет микролитара ЛЛПС узорака је примењено на μ-Слиде ангиогенезне бунаре (Ибиди ГмбХ, Грефелфинг, Немачка).Добијене слике су фокусиране на 20 µм изнад дна бунара за оптималну радну удаљеност објектива за суспендоване капљице и на ~1 µм за сплавове и тачке са аксијалном резолуцијом од најмање 0,25 µм/пиксел и временом кашњења од 400 µс/пиксел.Изаберите податке применом прага интензитета заснованог на просечном интензитету позадинског сигнала (ПБГ, средња вредност + 2σ) за сваки канал, тако да се бирају само капљице течног протеина, сплавови или тачке, филтрирајући свако могуће порекло из дисперговане фазе.Да бисмо анализирали животни век сваке врсте (τ) сваког канала (зелено, „г“ за АФ488 и црвено, „р“ за Атто647Н), одабрали смо регионе од интереса (РОИ) који садрже капљице, сплавове или мрље (додатна слика 1 ).8б) и извео их прилагођавањем њиховог животног распада (τД, τР и τП за капљице, сплавове или тачке, респективно, види додатну слику 8ц) у сваком каналу користећи анализу уклапања репа и двокомпонентни модел распадања.Просек τ од τ .РОИ који су произвели премало фотона за мулти-експоненцијално уклапање искључени су из анализе.Коришћена граница је била <104 фотона за сплавове и тачке и 103 за капи.Капљице имају нижи праг јер је тешко добити криве распада са већим вредностима интензитета, пошто су капљице у пољу слике обично мање и мање бројне.РОИ са бројем фотона изнад границе акумулације фотона (подешено на >500 бројева/пиксел) такође су одбачени за анализу.Ускладите криву опадања интензитета добијену из региона од интереса са интензитетом од 90% максимума (нешто након максималног интензитета опадања) од почетка радног века да бисте обезбедили минималне ИРФ сметње уз задржавање исте за све опадање интензитета подешавања Релативни временски оквир Анализирано је 25 до 50 РОИ за сплавове и тачке и 15-25 РОИ за капи, слике изабране из више од 4 понављања снимљена из најмање 3 независна експеримента.Двострани т-тестови су коришћени за процену статистичких разлика између врста или између коацерватних система.За пиксел-по-пиксел анализу животног века (τ), израчунато је укупно слабљење животног века у пољу за сваки канал и извршена је апроксимација 2/3-компонентног експоненцијалног модела слабљења.Пригушење животног века за сваки пиксел је затим подешено коришћењем претходно израчунатих вредности τ, што је резултирало псеудобојном ФЛИМ фит сликом.Опсег животног века репа био је исти на свим сликама истог канала, а сваки распад је произвео довољно фотона да обезбеди поуздано уклапање.За ФРЕТ анализу, пиксели су одабрани применом нижег прага интензитета од 100 фотона, што је просечно позадински сигнал (ФБГ) од 11 фотона.Интензитет флуоресценције сваког канала је коригован експериментално утврђеним факторима корекције: 69 спектрални преслушавање α је било 0,004, директна ексцитација β је била 0,0305, ефикасност детекције γ је била 0,517.Ефикасност ФРЕТ на нивоу пиксела се затим израчунава помоћу следеће једначине:
где је ФДД интензитет флуоресценције примећен у донорском (зеленом) каналу, ФДА је интензитет флуоресценције примећен у акцепторском (црвеном) каналу под индиректном ексцитацијом, а ФАА је интензитет флуоресценције примећен у акцепторском (црвеном) каналу под директном ексцитацијом ( ПИТА).У каналу се уочавају импулси интензитета флуоресценције).
Ставите 100 µл ЛЛПС реакционих раствора који садрже 25 µМ необележеног мономерног Тау441 (са или без 25 µМ αС) у ЛЛПС пуфер (допуњен као горе) на невезујуће микроплоче са 96 јажица са слојем лепљиве фолије и микроскопом формирање капљица је проверено од стране ВФ еквилибрација.у року од 10 мин.После 48 сати инкубације на собној температури, потврђено је присуство протеинских сплавова и пега.Затим пажљиво уклоните течност преко сплавова из бунара, затим додајте 50 Л пуфера за дисоцијацију (10 мМ ХЕПЕС, пХ 7,4, 1 М НаЦл, 1 мМ ДТТ) и инкубирајте 10 мин.Висока концентрација соли осигурава да се ЛЛПС неће поновити због резидуалног ПЕГ-а, а могући протеински склопови формирани само електростатичким интеракцијама ће бити растављени.Дно бунарчића је затим пажљиво састругано врхом микропипете и добијени раствор је пребачен у празан бунар за посматрање.Након инкубације узорака са 50 μМ ТхТ током 1 х, присуство изолованих мрља је проверено ВФ микроскопијом.Припремите соникиране αС фибриле инкубацијом 300 µл 70-µМ раствора αС у ПБС са пХ 7,4, натријум азидом 0,01% на 37 °Ц и 200 рпм на орбиталном шејкеру током 7 дана.Раствор је затим центрифугиран на 9600×г током 30 минута, пелета је ресуспендована у ПБС пХ 7,4 и соникирана (1 мин, 50% циклус, 80% амплитуда у Вибра-Целл ВЦ130 соникатору, Соницс, Невтон, УСА) узорци фибрила са релативно уједначеном дистрибуцијом малих фибрила.
ФЦС/ФЦЦС анализа и детекција двобојних коинциденција (ТЦЦД) изведени су на истом МТ200 временски разрешеном флуоресцентном конфокалном микроскопу (Пицо-Куант, Берлин, Немачка) коришћеном за експерименте ФЛИМ-ФРЕТ микроскопије користећи ПИЕ режим.Снага ласера ​​за ове експерименте је додата на 6,0 µВ (481 нм) и 6,2 µВ (637 нм).Комбинација ових ласерских снага је изабрана да произведе сличну осветљеност за парове коришћених флуорофора уз постизање оптималне стопе бројања и избегавање фотобељења и засићења.И прикупљање података и анализа обављени су коришћењем комерцијално доступног софтвера СимпхоТиме64 верзија 2.3 (ПицоКуант, Берлин, Немачка).
Узорци изолованих αС/Тау агрегата добијених коришћењем ЛЛПС-а се разблажују у изолационом пуферу до одговарајуће мономолекуларне концентрације (обично 1:500 разблажења, пошто су агрегати већ у ниским концентрацијама када су изоловани из узорака коацервата).Узорци су нанети директно на покривна стакла (Цорнинг, САД) претходно премазана раствором БСА у концентрацији од 1 мг/мЛ.
За ПИЕ-смФРЕТ анализу у зеленом и црвеном каналу, примењен је нижи праг интензитета од 25 фотона да би се филтрирали сигнали ниског интензитета узроковани мономерним догађајима (имајте на уму да су мономери бројнији од агрегираних узорака у поређењу са изолованим агрегатима).Овај праг је израчунат као пет пута већи од просечног интензитета мономерног αС добијеног анализом узорака чистог мономера да би се посебно одабрали агрегати за анализу.ПИЕ погонско коло, заједно са ТСЦПЦ аквизицијом података, омогућило је примену доживотног тежинског филтера који помаже да се елиминишу позадинске и спектралне преслушавања.Интензитет бакље одабран коришћењем горњих прагова је коригован коришћењем просечног позадинског сигнала одређеног из хистограма појављивања у односу на интензитет/бину узорака само у пуферу.Рафали повезани са великим агрегатима обично заузимају неколико узастопних бинова у временском трагу (подешено на 1 мс).У овим случајевима је изабрана канта максималне снаге.За ФРЕТ и стехиометријску анализу коришћен је теоретски одређен гама фактор γ (0,517).Доприноси спектралног преслушавања и директног побуђивања су занемарљиви (одређени експериментално) при коришћеној снази побудног ласера.Ефикасност и стехиометрија ФРЕТ-а у експлозији се израчунава на следећи начин.