Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Клизачи који приказују три чланка по слајду.Користите дугмад назад и следећи да бисте се кретали кроз слајдове или дугмад контролора слајдова на крају да бисте се кретали кроз сваки слајд.

317 Добављачи цеви од нерђајућег челика

Табела хемијског састава материјала од нерђајућег челика

СПАЦА6 је површински протеин изражен спермом који је критичан за фузију гамета током сексуалне репродукције сисара.Упркос овој фундаменталној улози, специфична функција СПАЦА6 је слабо схваћена.Разјашњавамо кристалну структуру екстрацелуларног домена СПАЦА6 при резолуцији од 2, 2 А, откривајући протеин са два домена састављен од четвороланчаног снопа и Иг-сличних β-сендвича спојених квази-флексибилним линкерима.Ова структура подсећа на ИЗУМО1, још један протеин повезан са фузијом гамета, чинећи СПАЦА6 и ИЗУМО1 оснивачима суперфамилије протеина повезаних са оплодњом која се овде назива ИСТ суперфамилија.ИСТ суперфамилија је структурно дефинисана својим уврнутим снопом са четири спирале и паром ЦКСКСЦ мотива повезаних са дисулфидом.АлпхаФолд претрага људског протеома заснована на структури идентификовала је додатне чланове протеина ове суперфамилије;нарочито, многи од ових протеина су укључени у фузију гамета.Структура СПАЦА6 и њен однос са другим члановима ИСТ суперфамилије пружају карику која недостаје у нашем знању о фузији гамета сисара.
Сваки људски живот почиње са две одвојене хаплоидне полне ћелије: очевим сперматозоидом и мајчиним јајним ћелијама.Ова сперма је победник интензивног процеса селекције током којег милиони сперматозоида пролазе кроз женски генитални тракт, савладавају различите препреке1 и пролазе кроз капацитацију, чиме се појачава њихова покретљивост и процес површинских компоненти2,3,4.Чак и ако се сперматозоид и ооцит пронађу, процес још није завршен.Ооцит је окружен слојем кумулусних ћелија и гликопротеинском баријером званом зона пеллуцида, кроз коју сперматозоиди морају проћи да би ушли у ооцит.Сперматозоиди користе комбинацију молекула површинске адхезије и ензима повезаних са мембраном и излучених ензима да би превазишли ове коначне баријере5.Ови молекули и ензими се углавном складиште у унутрашњој мембрани и акрозомалном матриксу и откривају се када се спољна мембрана сперме лизира током акросомалне реакције6.Последњи корак на овом интензивном путовању је фузија сперматозоида и јајета, у којој две ћелије спајају своје мембране да би постале један диплоидни организам7.Иако је овај процес револуционаран у људској репродукцији, неопходне молекуларне интеракције су слабо схваћене.
Поред оплодње гамета, хемија фузије два двослоја липида је опширно проучавана.Уопштено говорећи, фузија мембране је енергетски неповољан процес који захтева да протеински катализатор прође кроз структурну промену конформације која приближава две мембране, разбијајући њихов континуитет и изазивајући фузију8,9.Ови протеински катализатори су познати као фузогени и пронађени су у безбројним фузионим системима.Потребни су за улазак вируса у ћелије домаћина (нпр. гп160 код ХИВ-1, пораст у коронавирусима, хемаглутинин у вирусима грипа)10,11,12 плаценте (синцитин)13,14,15 и фузије које формирају гамете код нижих еукариота ( ХАП2/ГЦС1 код биљака, протиста и зглавкара) 16,17,18,19.Фузогени за људске гамете тек треба да буду откривени, иако се показало да је неколико протеина критично за везивање и фузију гамета.ЦД9 експримиран у ооцитима, трансмембрански протеин потребан за фузију мишјих и људских гамета, био је први који је откривен 21,22,23.Иако је његова прецизна функција и даље нејасна, вероватно је улога у адхезији, структури адхезионих жаришта на микроресицама јајета и/или тачна локализација површинских протеина ооцита 24,25,26.Два најтипичнија протеина која су критична за фузију гамета су протеин сперме ИЗУМО127 и протеин ооцита ЈУНО28, а њихово међусобно повезивање је важан корак у препознавању и адхезији гамета пре фузије.Мужјаци Изумо1 нокаут мишева и женке Јуно нокаут мишева су потпуно стерилни, у овим моделима сперматозоиди улазе у перивителински простор али се гамете не спајају.Слично, конфлуенција је смањена када су гамете третиране анти-ИЗУМО1 или ЈУНО27,29 антителима у експериментима ин витро оплодње код људи.
Недавно је откривена новооткривена група протеина експримираних сперматозоида фенотипски сличних ИЗУМО1 и ЈУНО20,30,31,32,33,34,35.Протеин 6 повезан са акрозомалном мембраном сперме (СПАЦА6) идентификован је као неопходан за оплодњу у великој студији мишје мутагенезе.Убацивање трансгена у ген Спаца6 производи нетаљиве сперматозоиде, иако се ови сперматозоиди инфилтрирају у перивителински простор 36 .Накнадне нокаут студије на мишевима потврдиле су да је Спаца6 неопходан за фузију гамета 30,32.СПАЦА6 се експресује скоро искључиво у тестисима и има образац локализације сличан оном код ИЗУМО1, наиме унутар интиме сперматозоида пре акросомалне реакције, а затим мигрира у екваторијални регион након акрозомалне реакције 30,32.Спаца6 хомолози постоје код разних сисара и других еукариота 30 и његов значај за фузију људских гамета је показано инхибицијом оплодње код људи ин витро отпорношћу на СПАЦА6 30 .За разлику од ИЗУМО1 и ЈУНО, детаљи структуре, интеракција и функције СПАЦА6 остају нејасни.
Да бисмо боље разумели фундаментални процес који лежи у основи фузије људске сперме и јајних ћелија, што ће нам омогућити да информишемо о будућим развојима у планирању породице и третману плодности, спровели смо СПАЦА6 структурне и биохемијске студије.Кристална структура екстрацелуларног домена СПАЦА6 показује сноп са четири спирале (4ХБ) и домен сличан имуноглобулину (сличан Иг) повезаним квази-флексибилним регионима.Као што је предвиђено у претходним студијама,7,32,37, структура домена СПАЦА6 је слична оној код људи ИЗУМО1, а два протеина деле необичан мотив: 4ХБ са троугластом спиралном површином и пар ЦКСКСЦ мотива повезаних са дисулфидом.Предлажемо да ИЗУМО1 и СПАЦА6 сада дефинишу већу, структурно сродну суперфамилију протеина повезаних са фузијом гамета.Користећи карактеристике јединствене за суперпородицу, спровели смо исцрпну претрагу за АлпхаФолд структурним људским протеомом, идентификујући додатне чланове ове суперфамилије, укључујући неколико чланова укључених у фузију и/или оплодњу гамета.Сада се чини да постоји заједнички структурни набор и суперфамилија протеина повезаних са фузијом гамета, а наша структура пружа молекуларну мапу овог важног аспекта механизма фузије људских гамета.
СПАЦА6 је једнопролазни трансмембрански протеин са једним Н-везаним гликаном и шест наводних дисулфидних веза (слике С1а и С2).Експресирали смо екстрацелуларни домен хуманог СПАЦА6 (остаци 27-246) у Дросопхила С2 ћелијама и пречистили протеин коришћењем афинитета никла, измене катјона и хроматографије искључивања величине (слика С1б).Пречишћени СПАЦА6 ектодомен је веома стабилан и хомоген.Анализа коришћењем хроматографије искључивања величине у комбинацији са полигоналним расејањем светлости (СЕЦ-МАЛС) открила је један пик са израчунатом молекулском тежином од 26,2 ± 0,5 кДа (слика С1ц).Ово је у складу са величином СПАЦА6 мономерног ектодомена, што указује да се олигомеризација није догодила током пречишћавања.Поред тога, спектроскопија кружног дихроизма (ЦД) открила је мешовиту α/β структуру са тачком топљења од 51,3 °Ц (слика С1д,е).Деконволуција ЦД спектра открила је 38,6% α-хеликалних и 15,8% β-ланчаних елемената (слика С1д).
СПАЦА6 ектодомен је кристализован коришћењем насумичне матрице38 што је резултирало скупом података са резолуцијом од 2,2 А (табела 1 и слика С3).Користећи комбинацију молекуларне супституције засноване на фрагментима и података о фазама САД са излагањем бромиду за одређивање структуре (Табела 1 и Слика С4), коначни рафинисани модел се састоји од остатака 27–246.У време када је структура одређена, није било доступних експерименталних или АлпхаФолд структура.СПАЦА6 ектодомен има димензије 20 А × 20 А × 85 А, састоји се од седам спирала и девет β-ланаца и има издужени терцијарни набор стабилизован са шест дисулфидних веза (Слика 1а, б).Слаба електронска густина на крају бочног ланца Асн243 указује да је овај остатак Н-везана гликозилација.Структура се састоји од два домена: Н-терминалног снопа са четири спирале (4ХБ) и Ц-терминалног Иг-сличног домена са средњим зглобним регионом између њих (слика 1ц).
а Структура екстрацелуларног домена СПАЦА6.Стрип дијаграм екстрацелуларног домена СПАЦА6, боја ланца од Н до Ц-краја од тамноплаве до тамно црвене.Цистеини укључени у дисулфидне везе су истакнути магента.б Топологија екстрацелуларног домена СПАЦА6.Користите исту шему боја као на слици 1а.ц СПАЦА6 екстрацелуларни домен.4ХБ, шарке и дијаграми домена сличних Иг су обојени наранџастом, зеленом и плавом бојом.Слојеви нису нацртани у размери.
4ХБ домен СПАЦА6 укључује четири главна спирала (хеликса 1–4), који су распоређени у облику спиралне спирале (слика 2а), наизменично између антипаралелних и паралелних интеракција (слика 2б).Мала додатна једноокретна спирала (хеликс 1′) је положена окомито на сноп, формирајући троугао са спиралама 1 и 2. Овај троугао је благо деформисан у спирално увијеном паковању релативно густог паковања спирала 3 и 4 ( Слика 2а).
4ХБ дијаграм траке Н-терминала.б Поглед одозго на сноп од четири спирале, од којих је свака спирала истакнута тамно плавом бојом на Н-крају и тамноцрвеном на Ц-крају.ц Дијаграм спиралног точка одозго надоле за 4ХБ, са сваким остатком приказаним као круг означен једнословним кодом амино киселине;само четири аминокиселине на врху точка су нумерисане.Неполарни остаци су обојени жутом бојом, поларни ненаелектрисани остаци су обојени зеленом, позитивно наелектрисани остаци су обојени плавом бојом, а негативно наелектрисани остаци су обојени црвеном бојом.д Троугласте површине домена 4ХБ, са 4ХБ у наранџастој боји и шаркама у зеленој боји.Оба уметка показују дисулфидне везе у облику штапа.
4ХБ је концентрисан на унутрашње хидрофобно језгро које се састоји углавном од алифатичних и ароматичних остатака (слика 2ц).Језгро садржи дисулфидну везу између Цис41 и Цис55 која повезује спирале 1 и 2 заједно у горњи подигнути троугао (слика 2д).Две додатне дисулфидне везе су формиране између ЦКСКСЦ мотива у Хеликсу 1′ и другог ЦКСКСЦ мотива пронађеног на врху β-укоснице у пределу шарке (слика 2д).Конзервативни остатак аргинина са непознатом функцијом (Арг37) налази се унутар шупљег троугла који формирају спирале 1′, 1 и 2. Алифатски атоми угљеника Цβ, Цγ и Цδ Арг37 ступају у интеракцију са хидрофобним језгром, а његове гванидинске групе се циклично крећу између спирала 1′ и 1 преко интеракција између Тхр32 кичме и бочног ланца (слика С5а, б).Тир34 се протеже у шупљину остављајући две мале шупљине кроз које Арг37 може да ступи у интеракцију са растварачем.
Иг-слични β-сендвич домени су велика суперфамилија протеина који деле заједничку особину два или више вишеланчаних амфипатских β-листова који интерагују преко хидрофобног језгра 39. Ц-терминални Иг-сличан домен СПАЦА6 има исти образац и састоји се од два слоја (сл. С6а).Лист 1 је β-лист од четири ланца (ланци Д, Ф, Х и И) где ланци Ф, Х и И формирају антипаралелни распоред, а нити И и Д преузимају паралелну интеракцију.Табела 2 је мали антипаралелни дволанчани бета лист (ланци Е и Г).Уочена је унутрашња дисулфидна веза између Ц-краја Е ланца и центра Х ланца (Цис170-Цис226) (Слика С6б).Ова дисулфидна веза је аналогна дисулфидној вези у β-сендвич домену имуноглобулина40,41.
Четвороланчани β-лист се увија дуж целе дужине, формирајући асиметричне ивице које се разликују по облику и електростатици.Тања ивица је равна хидрофобна површина животне средине која се истиче у поређењу са преосталим неравним и електростатички разноликим површинама у СПАЦА6 (слика С6б,ц).Ореол изложених карбонил/амино група и поларних бочних ланаца окружује хидрофобну површину (слика С6ц).Шира маргина је покривена спиралним сегментом са капом који блокира Н-терминални део хидрофобног језгра и формира три водоничне везе са отвореном поларном групом окоснице Ф ланца (слика С6д).Ц-терминални део ове ивице формира велики џеп са делимично изложеним хидрофобним језгром.Џеп је окружен позитивним наелектрисањем због три сета двоструких остатака аргинина (Арг162-Арг221, Арг201-Арг205 и Арг212-Арг214) и централног хистидина (Хис220) (слика С6е).
Зглобни регион је кратак сегмент између спиралног домена и домена сличног Иг, који се састоји од једног антипаралелног троланчаног β-слоја (ланци А, Б и Ц), малог хеликса од 310 и неколико дугих насумичних спиралних сегмената.(Сл. С7).Чини се да мрежа ковалентних и електростатичких контаката у пределу шарке стабилизује оријентацију између 4ХБ и домена сличног Иг.Мрежа се може поделити на три дела.Први део укључује два ЦКСКСЦ мотива (27ЦКСКСЦ30 и 139ЦКСКСЦ142) који формирају пар дисулфидних веза између β-укоснице у шарки и 1′ хеликса у 4ХБ.Други део укључује електростатичке интеракције између Иг-сличног домена и шарке.Глу132 у шарки формира слани мост са Арг233 у домену сличном Иг и Арг135 у шарки.Трећи део укључује ковалентну везу између Иг-сличног домена и зглобног региона.Две дисулфидне везе (Цис124-Цис147 и Цис128-Цис153) повезују петљу шарке са линкером који је стабилизован електростатичким интеракцијама између Глн131 и функционалне групе кичме, омогућавајући приступ првом домену сличном Иг.ланац.
Структура ектодомена СПАЦА6 и појединачне структуре 4ХБ и Иг сличних домена коришћене су за тражење структурно сличних записа у базама података протеина 42 .Идентификовали смо подударања са високим Дали З скором, малим стандардним девијацијама и великим ЛАЛИ резултатима (последњи је број структурно еквивалентних остатака).Док је првих 10 погодака из пуне претраге ектодомена (Табела С1) имало прихватљив З-скор од >842, само претрага за 4ХБ или Иг сличан домен је показала да већина ових погодака одговара само β-сендвичима.свеприсутни набор који се налази у многим протеинима.Све три претраге у Далију дале су само један резултат: ИЗУМО1.
Дуго се сугерисало да СПАЦА6 и ИЗУМО1 деле структурне сличности7,32,37.Иако ектодомени ова два протеина повезана са фузијом гамета деле само 21% идентитета секвенце (слика С8а), комплексни докази, укључујући очувани образац дисулфидне везе и предвиђени домен сличан Ц-терминалном Иг у СПАЦА6, омогућили су ране покушаје да се изгради хомолошки модел А и СПАЦА6 миша користећи ИЗУМО1 као шаблон37.Наша структура потврђује ова предвиђања и показује прави степен сличности.У ствари, структуре СПАЦА6 и ИЗУМО137,43,44 деле исту архитектуру са два домена (слика С8б) са сличним 4ХБ и Иг-сличним β-сендвич доменима повезаним регионом шарке (слика С8ц).
ИЗУМО1 и СПАЦА6 4ХБ имају заједничке разлике у односу на конвенционалне спиралне снопове.Типични 4ХБ, попут оних пронађених у СНАРЕ протеинским комплексима укљученим у ендосомалну фузију 45,46, имају равномерно распоређене спирале које одржавају константну кривину око централне осе 47. Насупрот томе, спирални домени у ИЗУМО1 и СПАЦА6 су били изобличени, са променљивом кривином и неравномерно паковање (слика С8д).Заокрет, вероватно изазван троуглом формираним спиралама 1′, 1 и 2, задржан је у ИЗУМО1 и СПАЦА6 и стабилизован истим ЦКСКСЦ мотивом на спирали 1′.Међутим, додатна дисулфидна веза пронађена у СПАЦА6 (Цис41 и Цис55 ковалентно повезујући спирале 1 и 2 изнад) ствара оштрији врх на врху троугла, чинећи СПАЦА6 више уврнутим од ИЗУМО1, са израженијим троугловима шупљине.Поред тога, ИЗУМО1 недостаје Арг37 примећен у центру ове шупљине у СПАЦА6.Насупрот томе, ИЗУМО1 има типичније хидрофобно језгро од алифатичних и ароматичних остатака.
ИЗУМО1 има домен сличан Иг који се састоји од дволанчаног и петоланчаног β-листа43.Додатни ланац у ИЗУМО1 замењује калем у СПАЦА6, који ступа у интеракцију са Ф ланцем да ограничи водоничне везе кичме у ланцу.Занимљива тачка поређења је предвиђени површински набој Иг сличних домена два протеина.Површина ИЗУМО1 је негативније наелектрисана од површине СПАЦА6.Додатно пуњење се налази у близини Ц-краја окренутог према мембрани сперматозоида.У СПАЦА6, исти региони су били неутралнији или позитивно наелектрисани (слика С8е).На пример, хидрофобна површина (тање ивице) и позитивно наелектрисане јаме (шире ивице) у СПАЦА6 су негативно наелектрисане у ИЗУМО1.
Иако су веза и елементи секундарне структуре између ИЗУМО1 и СПАЦА6 добро очувани, структурно поравнање Иг-сличних домена показало је да се два домена разликују у својој општој оријентацији један у односу на други (слика С9).Спирални сноп ИЗУМО1 је закривљен око β-сендвича, стварајући претходно описани облик „бумеранга“ на око 50° од централне осе.Насупрот томе, спирални сноп у СПАЦА6 је био нагнут око 10 ° у супротном смеру.Разлике у овим оријентацијама су вероватно због разлика у региону шарки.На нивоу примарне секвенце, ИЗУМО1 и СПАЦА6 имају малу сличност секвенце на шарки, са изузетком цистеина, глицина и остатака аспарагинске киселине.Као резултат тога, водоничне везе и електростатичке мреже су потпуно различите.Елементе секундарне структуре β-листова деле ИЗУМО1 и СПАЦА6, иако су ланци у ИЗУМО1 много дужи и спирала 310 (хеликс 5) је јединствена за СПАЦА6.Ове разлике резултирају различитим оријентацијама домена за два иначе слична протеина.
Наша претрага Дали сервера открила је да су СПАЦА6 и ИЗУМО1 једине две експериментално одређене структуре ускладиштене у бази протеина које имају овај конкретан 4ХБ преклоп (Табела С1).Недавно је ДеепМинд (Алпхабет/Гоогле) развио АлпхаФолд, систем заснован на неуронској мрежи који може прецизно предвидети 3Д структуре протеина из примарних секвенци48.Убрзо након што смо решили структуру СПАЦА6, објављена је база података АлпхаФолд, која пружа моделе предвиђања структуре који покривају 98,5% свих протеина у људском протеому48,49.Користећи нашу решену СПАЦА6 структуру као модел претраге, претрага структурне хомологије за модел у АлпхаФолд људском протеому идентификовала је кандидате са могућим структурним сличностима са СПАЦА6 и ИЗУМО1.С обзиром на невероватну тачност АлпхаФолд-а у предвиђању СПАЦА6 (слика С10а) - посебно ектодомена од 1,1 А рмс у поређењу са нашом решеном структуром (слика С10б) - можемо бити сигурни да ће идентификована подударања СПАЦА6 вероватно бити тачна.
Претходно, ПСИ-БЛАСТ је тражио ИЗУМО1 кластер са три друга протеина повезана са спермом: ИЗУМО2, ИЗУМО3 и ИЗУМО450.АлпхаФолд је предвидео да се ови протеини ИЗУМО породице савијају у 4ХБ домен са истим обрасцем дисулфидне везе као ИЗУМО1 (Слике 3а и С11), иако им недостаје домен сличан Иг.Претпоставља се да су ИЗУМО2 и ИЗУМО3 једнострани мембрански протеини слични ИЗУМО1, док се ИЗУМО4 чини да се лучи.Функције протеина ИЗУМО 2, 3 и 4 у фузији гамета нису утврђене.Познато је да ИЗУМО3 игра улогу у биогенези акрозома током развоја сперматозоида51, а ИЗУМО протеин формира комплекс50.Конзервација ИЗУМО протеина код сисара, гмизаваца и водоземаца сугерише да је њихова потенцијална функција у складу са оном других познатих протеина повезаних са фузијом гамета, као што су ДЦСТ1/2, СОФ1 и ФИМП.
Дијаграм архитектуре домена ИСТ суперфамилије, са 4ХБ, шаркама и доменима сличним Иг истакнутим наранџастом, зеленом и плавом бојом.ИЗУМО4 има јединствен Ц-терминални регион који изгледа црно.Потврђене и претпостављене дисулфидне везе су приказане пуним и испрекиданим линијама, респективно.б ИЗУМО1 (ПДБ: 5Ф4Е), СПАЦА6, ИЗУМО2 (АлпхаФолд ДБ: АФ-К6УКСВ1-Ф1), ИЗУМО3 (АлпхаФолд ДБ: АФ-К5ВЗ72-Ф1), ИЗУМО4 (АлпхаФолд ДБ: АФ-К1ЗИЛ8-Ф95) (АлпхаФолд ДБ: АФ-К1ЗИЛ8-Ф95), и ДБ: АФ-К1ЗИЛ8-Ф1) : АФ-К1ЗИЛ8-Ф1) : АФ-К3КНТ9-Ф1) су приказане у истом опсегу боја као и панел А. Дисулфидне везе су приказане магента.ТМЕМ95, ИЗУМО2 и ИЗУМО3 трансмембранске спирале нису приказане.
За разлику од ИЗУМО протеина, сматра се да су други СПАЦА протеини (тј. СПАЦА1, СПАЦА3, СПАЦА4, СПАЦА5 и СПАЦА9) структурно различити од СПАЦА6 (слика С12).Само СПАЦА9 има 4ХБ, али се не очекује да има исту паралелно-антипаралелну оријентацију или исту дисулфидну везу као СПАЦА6.Само СПАЦА1 има сличан домен сличан Иг-у.АлпхаФолд предвиђа да СПАЦА3, СПАЦА4 и СПАЦА5 имају потпуно другачију структуру од СПАЦА6.Занимљиво је да је познато да СПАЦА4 такође игра улогу у оплодњи, али у већој мери од СПАЦА6, уместо да олакшава интеракцију између сперме и јајне ћелије зона пеллуцида52.
Наша АлпхаФолд претрага је нашла још једно подударање за ИЗУМО1 и СПАЦА6 4ХБ, ТМЕМ95.ТМЕМ95, један трансмембрански протеин специфичан за сперму, чини мушке мишеве неплодним када се аблатира 32,33.Сперматозоиди којима недостаје ТМЕМ95 имали су нормалну морфологију, покретљивост и способност да продру у зону пеллуцида и везују се за мембрану јајета, али се нису могли спојити са мембраном ооцита.Претходне студије су показале да ТМЕМ95 дели структурне сличности са ИЗУМО133.Заиста, АлпхаФолд модел је потврдио да је ТМЕМ95 4ХБ са истим паром ЦКСКСЦ мотива као ИЗУМО1 и СПАЦА6 и истом додатном дисулфидном везом између спирала 1 и 2 која се налази у СПАЦА6 (сл. 3а и С11).Иако ТМЕМ95 нема домен сличан Иг, он има регион са узорком дисулфидне везе сличан СПАЦА6 и ИЗУМО1 регионима шарке (слика 3б).У време објављивања овог рукописа, сервер за препринт је пријавио структуру ТМЕМ95, потврђујући резултат АлпхаФолд53.ТМЕМ95 је веома сличан СПАЦА6 и ИЗУМО1 и еволутивно је конзервиран већ код водоземаца (сл. 4 и С13).
ПСИ-БЛАСТ претрага је користила базе података НЦБИ СПАЦА6, ИЗУМО1-4, ТМЕМ95, ДЦСТ1, ДЦСТ2, ФИМП и СОФ1 да би се одредила позиција ових секвенци на стаблу живота.Растојања између тачака гранања нису приказана у размери.
Упадљива укупна структурна сличност између СПАЦА6 и ИЗУМО1 сугерише да су они оснивачи очуване структурне суперфамилије која укључује протеине ТМЕМ95 и ИЗУМО 2, 3 и 4.познати чланови: ИЗУМО1, СПАЦА6 и ТМЕМ95.Пошто само неколико чланова поседује домене сличне Иг, обележје ИСТ суперфамилије је 4ХБ домен, који има јединствене карактеристике заједничке свим овим протеинима: 1) Намотани 4ХБ са спиралама распоређеним у антипаралелној/паралелној алтернацији (Сл. . 5а), 2) сноп има троугласто лице које се састоји од две спирале унутар снопа и треће вертикалне спирале (сл. кључна област (слика 5ц). Познато је да ЦКСКСЦ мотив, који се налази у протеинима сличним тиоредоксину, функционише као редокс сензор 54,55,56, док се мотив код чланова породице ИСТ може повезати са протеин дисулфид изомеразама као што је ЕРп57 у фузији гамета.Улоге су повезане 57,58.
Чланови ИСТ суперфамилије су дефинисани са три карактеристичне карактеристике 4ХБ домена: четири спирале које се смењују између паралелне и антипаралелне оријентације, ба-троугласте спиралне површине снопа и ца ЦКСКСЦ двоструки мотив формиран између малих молекула.) Н-терминалне спирале (наранџаста) и β-укосница (зелена) регион шарке.
С обзиром на сличност између СПАЦА6 и ИЗУМО1, тестирана је способност првог да се веже за ИЗУМО1 или ЈУНО.Интерферометрија биослоја (БЛИ) је кинетички заснована метода везивања која је раније коришћена за квантификацију интеракције између ИЗУМО1 и ЈУНО.Након инкубације сензора обележеног биотином са ИЗУМО1 као мамцем са високом концентрацијом ЈУНО аналита, откривен је јак сигнал (слика С14а), што указује на промену дебљине биоматеријала причвршћеног за врх сензора изазвану везивањем.Слични сигнали (тј. ЈУНО спојен са сензором као мамац против ИЗУМО1 аналита) (слика С14б).Није откривен сигнал када је СПАЦА6 коришћен као аналит против ИЗУМО1 везаног за сензор или ЈУНО везаног за сензор (слика С14а, б).Одсуство овог сигнала указује на то да екстрацелуларни домен СПАЦА6 не реагује са екстрацелуларним доменом ИЗУМО1 или ЈУНО.
Пошто се БЛИ тест заснива на биотинилацији слободних лизинских остатака на протеину мамаца, ова модификација може спречити везивање ако су остаци лизина укључени у интеракцију.Поред тога, оријентација везивања у односу на сензор може створити стеричне препреке, тако да су конвенционални тестови повлачења такође изведени на рекомбинантним СПАЦА6, ИЗУМО1 и ЈУНО ектодоменима.Упркос томе, СПАЦА6 се није таложио са Хис-означеним ИЗУМО1 или Хис-означеним ЈУНО (Слика С14ц,д), што указује на никакву интеракцију у складу са оном уоченом у БЛИ експериментима.Као позитивну контролу, потврдили смо интеракцију ЈУНО-а са означеним Хис ИЗУМО1 (слике С14е и С15).
Упркос структурној сличности између СПАЦА6 и ИЗУМО1, немогућност СПАЦА6 да веже ЈУНО није изненађујућа.Површина људског ИЗУМО1 има више од 20 остатака који су у интеракцији са ЈУНО, укључујући остатке из сваког од три региона (иако се већина њих налази у региону шарке) (слика С14ф).Од ових остатака, само један је конзервиран у СПАЦА6 (Глу70).Док су многе замене остатака задржале своја оригинална биохемијска својства, есенцијални Арг160 остатак у ИЗУМО1 замењен је негативно наелектрисаним Асп148 у СПАЦА6;претходне студије су показале да мутација Арг160Глу у ИЗУМО1 скоро потпуно укида везивање за ЈУНО43.Поред тога, разлика у оријентацији домена између ИЗУМО1 и СПАЦА6 значајно је повећала површину ЈУНО-везујућег места еквивалентног региона на СПАЦА6 (слика С14г).
Упркос познатој потреби за СПАЦА6 за фузију гамета и његовој сличности са ИЗУМО1, чини се да СПАЦА6 нема еквивалентну функцију везивања ЈУНО.Стога смо настојали да комбинујемо наше структурне податке са доказима важности које пружа еволуциона биологија.Поравнање секвенци хомолога СПАЦА6 показује очување заједничке структуре изван сисара.На пример, остаци цистеина су присутни чак и код далеко сродних водоземаца (слика 6а).Користећи ЦонСурф сервер, подаци о задржавању вишеструког поравнања секвенци од 66 секвенци су мапирани на површину СПАЦА6.Ова врста анализе може показати који су остаци сачувани током еволуције протеина и може указати који површински региони играју улогу у функцији.
а Поравнање секвенце СПАЦА6 ектодомена из 12 различитих врста припремљених коришћењем ЦЛУСТАЛ ОМЕГА.Према ЦонСурф анализи, најконзервативније позиције су означене плавом бојом.Цистеински остаци су означени црвеном бојом.Границе домена и елементи секундарне структуре приказани су на врху поравнања, где стрелице означавају β-ланчеве, а таласи указују на спирале.НЦБИ приступни идентификатори који садрже секвенце су: човек (Хомо сапиенс, НП_001303901), мандрила (Мандрилус леуцопхаеус, КСП_011821277), капуцин мајмун (Цебус мимиц, КСП_017359366), коњ (Еку1006, Еку106) с орца3_23 КСП_032_034) .), овца (Овис ариес, КСП_014955560), слон (Локодонта африцана, КСП_010585293), пас (Цанис лупус фамилиис, КСП_025277208), миш (Мус мусцулус, НП_001156381, НП_001156381, Тасхар КСПрис06381, Тасхар КСПрис06381) _0318), Платипус, 8) , 61_89 и Жаба бик (Буфо буфо, КСП_040282113).Нумерација је заснована на људском поретку.б Површински приказ структуре СПАЦА6 са 4ХБ на врху и доменом сличним Иг на дну, боје засноване на проценама очувања са ЦонСурф сервера.Најбоље очувани делови су плаве боје, средње очувани делови беле, а најмање очувани жуте боје.љубичасти цистеин.Три површинске закрпе које демонстрирају висок ниво заштите приказане су на уметцима означеним закрпе 1, 2 и 3. 4ХБ цртани филм је приказан на уметку у горњем десном углу (иста шема боја).
Структура СПАЦА6 има три високо очувана површинска региона (слика 6б).Закрпа 1 обухвата 4ХБ и регион шарке и садржи два очувана ЦКСКСЦ дисулфидна моста, Арг233-Глу132-Арг135-Сер144 мрежу шарки (слика С7) и три конзервисана спољна ароматична остатка (Пхе31, Тир73, Пхе137).шири обод домена сличног Иг (слика С6е), који представља неколико позитивно наелектрисаних остатака на површини сперматозоида.Занимљиво је да овај фластер садржи епитоп антитела за који је раније показано да омета функцију СПАЦА6 30.Регион 3 обухвата шарку и једну страну домена сличног Иг;овај регион садржи конзервисане пролине (Про126, Про127, Про150, Про154) и поларне/наелектрисане остатке окренуте ка споља.Изненађујуће, већина остатака на површини 4ХБ је веома варијабилна (слика 6б), иако је набор очуван у целом хомологу СПАЦА6 (као што указује конзервативизам језгра хидрофобног снопа) и изван ИСТ суперфамилије.
Иако је ово најмањи регион у СПАЦА6 са најмање детектабилних елемената секундарне структуре, многи остаци шарки (укључујући регион 3) су високо конзервирани међу СПАЦА6 хомолозима, што може указивати на то да оријентација спиралног снопа и β-сендвича игра улогу.као конзервативац.Међутим, упркос обимним водоничним везама и електростатичким мрежама у пределу шарке СПАЦА6 и ИЗУМО1, доказ унутрашње флексибилности може се видети у поравнању вишеструких дозвољених структура ИЗУМО137,43,44.Поравнање појединачних домена се добро преклапало, али је оријентација домена једни према другима варирала од 50° до 70° у односу на централну осе (слика С16).Да би се разумела конформациона динамика СПАЦА6 у раствору, изведени су САКСС експерименти (слика С17а,б).Аб инитио реконструкција СПАЦА6 ектодомена била је у складу са структуром кристала штапа (слика С18), иако је Краткијев дијаграм показао одређени степен флексибилности (слика С17б).Ова конформација је у супротности са ИЗУМО1, у којој невезани протеин поприма облик бумеранга иу решетки иу раствору43.
Да би се специфично идентификовао флексибилни регион, спроведена је масена спектроскопија измене водоник-деутеријум (Х-ДКСМС) на СПАЦА6 и упоређена са подацима претходно добијеним на ИЗУМО143 (слика 7а,б).СПАЦА6 је очигледно флексибилнији од ИЗУМО1, на шта указује већа размена деутеријума у ​​целој структури након 100.000 с размене.У обе структуре, Ц-терминални део зглобног региона показује висок ниво размене, што вероватно дозвољава ограничену ротацију 4ХБ и Иг сличних домена у односу један на други.Занимљиво је да је Ц-терминални део шарке СПАЦА6, који се састоји од остатка 147ЦДЛПЛДЦП154, високо конзервирани регион 3 (слика 6б), што вероватно указује да је флексибилност међудомена еволутивно очувана карактеристика СПАЦА6.Према анализи флексибилности, подаци о термичком топљењу ЦД-а показали су да је СПАЦА6 (Тм = 51,2°Ц) мање стабилан од ИЗУМО1 (Тм = 62,9°Ц) (сл. С1е и С19).
а Х-ДКСМС слике СПАЦА6 и б ИЗУМО1.Проценат размене деутеријума одређен је у назначеним временским тачкама.Нивои размене водоник-деутеријум су означени бојом на скали градијента од плаве (10%) до црвене (90%).Црне кутије представљају области високе размене.Границе 4ХБ, шарке и домена сличног Иг уочене у кристалној структури приказане су изнад примарне секвенце.Нивои размене деутеријума на 10 с, 1000 с и 100 000 с уцртани су на тракастом графикону који је постављен на транспарентне молекуларне површине СПАЦА6 и ИЗУМО1.Делови структура са нивоом размене деутеријума испод 50% су обојени бело.Области изнад 50% размене Х-ДКСМС су обојене у скали градијента.
Употреба ЦРИСПР/Цас9 и генетских стратегија за нокаутирање мишјих гена довела је до идентификације неколико фактора важних за везивање и фузију сперме и јајне ћелије.Осим добро окарактерисане интеракције ИЗУМО1-ЈУНО и ЦД9 структуре, већина протеина повезаних са фузијом гамета остаје структурно и функционално загонетна.Биофизичка и структурна карактеризација СПАЦА6 је још један део молекуларне слагалице адхезије/фузије током оплодње.
Чини се да су СПАЦА6 и други чланови суперфамилије ИСТ високо очувани код сисара, као и код појединачних птица, гмизаваца и водоземаца;у ствари, сматра се да је СПАЦА6 чак потребан за оплодњу код зебрице 59. Ова дистрибуција је слична другим познатим протеинима повезаним са фузијом гамета као што су ДЦСТ134, ДЦСТ234, ФИМП31 и СОФ132, што сугерише да су ови фактори дефицијентни за ХАП2 (такође познати као ГЦС1) протеини који су одговорни за каталитичку активност многих протиста., биљке и зглавкари.Оплођени фузиони протеини 60, 61. Упркос снажној структурној сличности између СПАЦА6 и ИЗУМО1, нокаутирање гена који кодирају било који од ових протеина је довело до неплодности код мужјака мишева, што указује да њихове функције у фузији гамета нису дуплициране..У ширем смислу, ниједан од познатих протеина сперме потребних за фазу адхезије фузије није сувишан.
Остаје отворено питање да ли СПАЦА6 (и други чланови ИСТ суперфамилије) учествују у интергаметским спојевима, формирају интрагаметске мреже за регрутовање важних протеина у тачке фузије, или можда чак делују као неухватљиви фузогени.Студије ко-имунопреципитације у ћелијама ХЕК293Т откриле су интеракцију између ИЗУМО1 пуне дужине и СПАЦА632.Међутим, наши рекомбинантни ектодомени нису интераговали ин витро, што сугерише да су интеракције виђене у Нода ет ал.оба су избрисана у конструкту (обратите пажњу на цитоплазматски реп ИЗУМО1, за који се показало да није неопходан за оплодњу62).Алтернативно, ИЗУМО1 и/или СПАЦА6 могу захтевати специфично везујуће окружење које не репродукујемо ин витро, као што су физиолошки специфичне конформације или молекуларни комплекси који садрже друге протеине (познате или још увек неоткривене).Иако се верује да ИЗУМО1 ектодомен посредује везивање сперматозоида за јаје у перивителинском простору, сврха ектодомена СПАЦА6 је нејасна.
Структура СПАЦА6 открива неколико очуваних површина које могу бити укључене у интеракције протеин-протеин.Очувани део региона шарке који се налази непосредно поред мотива ЦКСКСЦ (означен као закрпа 1 изнад) има неколико ароматичних остатака окренутих ка споља који су често повезани са хидрофобним и π-слаганим интеракцијама између биомолекула.Широке стране Иг-сличног домена (регион 2) формирају позитивно наелектрисан жлеб са високо конзервираним Арг и Хис остацима, а антитела против овог региона су претходно коришћена да блокирају фузију гамета 30 .Антитело препознаје линеарни епитоп 212РИРПАКЛТХРГТФС225, који има три од шест аргининских остатака и високо очуван Хис220.Није јасно да ли је дисфункција последица блокаде ових специфичних остатака или читавог региона.Локација овог јаза у близини Ц-терминуса β-сендвича указује на цис-интеракције са суседним протеинима сперме, али не и са протеинима ооцита.Штавише, задржавање веома флексибилног сплета богатог пролином (место 3) унутар шарке може бити место интеракције протеин-протеин или, што је вероватније, указати на задржавање флексибилности између два домена.Пол је важан за непознату улогу СПАЦА6.спајање гамета.
СПАЦА6 има својства међућелијских адхезивних протеина, укључујући Иг-слике β-сендвиче.Многи адхезивни протеини (нпр. кадхерини, интегрини, адхезини и ИЗУМО1) поседују један или више β-сендвич домена који проширују протеине од ћелијске мембране до њихових циљева животне средине63,64,65.Иг-сличан домен СПАЦА6 такође садржи мотив који се обично налази у β-сендвичима адхезије и кохезије: дублети паралелних нити на крајевима β-сендвича, познати као механичке стезаљке66.Верује се да овај мотив повећава отпорност на силе смицања, што је драгоцено за протеине укључене у међућелијске интеракције.Међутим, упркос овој сличности са адхезинима, тренутно нема доказа да СПАЦА6 реагује са беланцима јајета.СПАЦА6 ектодомен није у стању да се веже за ЈУНО, а ћелије ХЕК293Т које експримирају СПАЦА6, као што је овде приказано, тешко ступају у интеракцију са ооцитима којима недостаје зона 32.Ако СПАЦА6 успостави интергаметске везе, ове интеракције могу захтевати пост-транслационе модификације или стабилизацију помоћу других протеина сперме.У прилог последњој хипотези, сперматозоиди са недостатком ИЗУМО1 везују се за ооците, показујући да су молекули који нису ИЗУМО1 укључени у корак адхезије гамете 27.
Многи вирусни, ћелијски и развојни фузиони протеини имају својства која предвиђају њихову функцију као фузогена.На пример, вирусни фузиони гликопротеини (класе И, ИИ и ИИИ) имају хидрофобни фузиони пептид или петљу на крају протеина који је уметнут у мембрану домаћина.Мапа хидрофилности ИЗУМО143 и структура (утврђена и предвиђена) ИСТ суперфамилије нису показала очигледан хидрофобни фузиони пептид.Дакле, ако било који протеин у ИСТ суперфамилији функционише као фузоген, они то раде на начин другачији од других познатих примера.
У закључку, функције чланова ИСТ суперфамилије протеина повезаних са фузијом гамета остају примамљива мистерија.Наш карактерисани рекомбинантни молекул СПАЦА6 и његова решена структура пружиће увид у односе између ових заједничких структура и њихове улоге у везивању и фузији гамета.
ДНК секвенца која одговара предвиђеном хуманом СПАЦА6 ектодомену (НЦБИ приступни број НП_001303901.1; остаци 27–246) је оптимизована кодоном за експресију у ћелијама Дросопхила меланогастер С2 и синтетизована као фрагмент гена са секвенцом која кодира Козак Геном (Еурофин)., сигнал секреције БиП и одговарајући 5′ и 3′ крајеви за клонирање овог гена независно од лигације у пМТ експресиони вектор на основу промотора металотионеина модификованог за селекцију са пуромицином (пМТ-пуро).пМТ-пуро вектор кодира место цепања тромбина праћено 10к-Хис Ц-терминалном ознаком (Слика С2).
Стабилна трансфекција СПАЦА6 пМТ-пуро вектора у ћелије Д. меланогастер С2 (Гибцо) изведена је слично протоколу који се користи за ИЗУМО1 и ЈУНО43.С2 ћелије су одмрзнуте и узгајане у Шнајдеровом медијуму (Гибцо) са додатком финалне концентрације од 10% (в/в) топлотно инактивираног феталног телећег серума (Гибцо) и 1Кс антимикотичког антибиотика (Гибцо).Ћелије раног пролаза (3,0 к 106 ћелија) су постављене у појединачне јажице плоча са 6 бунарчића (Цорнинг).После 24 сата инкубације на 27°Ц, ћелије су трансфектоване мешавином од 2 мг СПАЦА6 пМТ-пуро вектора и Еффецтене трансфекционог реагенса (Киаген) у складу са протоколом произвођача.Трансфектоване ћелије су инкубиране 72 сата, а затим сакупљене са 6 мг/мл пуромицина.Ћелије су затим изоловане из комплетног Сцхнеидер-овог медијума и стављене у Инсецт-КСПРЕСС медијум без серума (Лонза) за производњу протеина великих размера.Серија од 1 Л С2 ћелијске културе је узгајана до 8-10 × 106 мл-1 ћелија у 2 Л вентилираној полипропиленској Ерленмајер тиквици са равним дном, а затим стерилисана са коначном концентрацијом од 500 µМ ЦуСО4 (Миллипоре Сигма) и стерилно филтрирана.индуковано.Индуковане културе су инкубиране на 27°Ц на 120 рпм током четири дана.
Кондиционирани медијум који садржи СПАЦА6 је изолован центрифугирањем на 5660×г на 4°Ц, а затим системом за филтрацију са тангенцијалним протоком Центрамате (Палл Цорп) са 10 кДа МВЦО мембраном.Нанесите концентровани медијум који садржи СПАЦА6 на колону од 2 мл Ни-НТА агарозне смоле (Киаген).Ни-НТА смола је испрана са 10 запремина колоне (ЦВ) пуфера А, а затим је додат 1 ЦВ пуфера А да би се добила коначна концентрација имидазола од 50 мМ.СПАЦА6 је елуиран са 10 мл пуфера А са додатком имидазола до коначне концентрације од 500 мМ.Тромбин рестрикционе класе (Миллипоре Сигма) је додат директно у цев за дијализу (МВЦО 12-14 кДа) у 1 јединици по мг СПАЦА6 у односу на 1 Л 10 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,5 и 150 мМ НаЦл (пуфер Б) за дијализу.) на 4°Ц током 48 сати.СПАЦА6 раздвојен тромбином је затим разблажен троструко да би се смањила концентрација соли и стављен у колону за измене катјона од 1 мл МоноС 5/50 ГЛ (Цитива/ГЕ) еквилибрисану са 10 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,5.Катионски измењивач је испран са 3 ОК 10 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,5, затим је СПАЦА6 елуиран линеарним градијентом од 0 до 500 мм НаЦл у 10 мм Трис-ХЦл, пХ 7,5 за 25 ОК.После јоноизмењивачке хроматографије, СПАЦА6 је концентрован до 1 мл и елуиран изократски са ЕНрицх СЕЦ650 10 к 300 колоне (БиоРад) еквилибрисан са пуфером Б. Према хроматограму, фракције сакупљене и концентроване које садрже СПАЦА6.Чистоћа је контролисана Цоомассие обојеном електрофорезом на 16% СДС-полиакриламидном гелу.Концентрација протеина је квантификована апсорбанцијом на 280 нм коришћењем Беер-Ламбертог закона и теоријског коефицијента моларне екстинкције.
Пречишћени СПАЦА6 је дијализован преко ноћи против 10 мМ натријум фосфата, пХ 7,4 и 150 мМ НаФ и разблажен до 0,16 мг/мЛ пре анализе ЦД спектроскопијом.Спектрално скенирање ЦД-ова таласне дужине од 185 до 260 нм је прикупљено на спектрополариметру Јасцо Ј-1500 коришћењем кварцних кивета са дужином оптичке путање од 1 мм (Хелма) на 25°Ц брзином од 50 нм/мин.ЦД спектри су кориговани на основу основне линије, усредњени за 10 аквизиција и конвертовани у средњу резидуалну елиптичност (θМРЕ) у степенима цм2/дмол:
где је МВ молекулска тежина сваког узорка у Да;Н је број аминокиселина;θ је елиптичност у милистепенима;д одговара дужини оптичке путање у цм;концентрација протеина у јединицама.