304 Заварена намотана цијев / цев од нехрђајућег челика, биосинтетички потенцијал глобалног морског микробиома

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Клизачи који приказују три чланка по слајду.Користите дугмад назад и следећи да бисте се кретали кроз слајдове или дугмад контролора слајдова на крају да бисте се кретали кроз сваки слајд.

Детаљан опис производа

304 Заварене намотане цеви/цеви од нерђајућег челика
1. Спецификација: цев / цев од нерђајућег челика
2. Тип: заварени или бешавни
3. Стандард: АСТМ А269, АСТМ А249
4. ОД цеви од нерђајућег челика: 6 мм до 25,4 мм
5. Дужина: 600-3500ММ или према захтеву купца.
6. Дебљина зида: 0,2 мм до 2,0 мм.

7. Толеранција: ОД: +/-0,01 мм;Дебљина: +/-0,01%.

8. Величина унутрашње рупе завојнице: 500ММ-1500ММ (може се подесити према захтевима купаца)

9. Висина завојнице: 200ММ-400ММ (може се подесити према захтевима купаца)

10. Површина: Светла или жарена
11. Материјал: 304, 304Л, 316Л, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, легура 625, 825, 2205, 2507 итд.
12. Паковање: ткане кесе у дрвеној кутији, дрвена палета, дрвена осовина или према захтеву купца
13. Тест: хемијска компонента, граница течења, затезна чврстоћа, мерење тврдоће
14. Гаранција: Инспекција треће стране (на пример: СГС ТВ) итд.
15. Примена: Декорација, намештај, транспорт уља, измењивач топлоте, израда ограда, израда папира, аутомобили, прерада хране, медицинска итд.

Природне микробне заједнице су филогенетски и метаболички разноврсне.Поред недовољно проучених група организама1, ова разноликост такође има богат потенцијал за откривање еколошки и биотехнолошки значајних ензима и биохемијских једињења2,3.Међутим, проучавање ове разноликости како би се одредили геномски путеви који синтетишу таква једињења и везују их за одговарајуће домаћине остаје изазов.Биосинтетички потенцијал микроорганизама у отвореном океану остаје углавном непознат због ограничења у анализи података о резолуцији читавог генома на глобалном нивоу.Овде истражујемо разноврсност и разноликост биосинтетичких генских кластера у океану интеграцијом око 10.000 микробних генома из култивисаних ћелија и појединачних ћелија са више од 25.000 новореконструисаних нацрт генома из преко 1.000 узорака морске воде.Ови напори су идентификовали око 40.000 претпостављених, углавном нових биосинтетских генских кластера, од којих су неки пронађени у претходно несумњивим филогенетским групама.У овим популацијама идентификовали смо лозу обогаћену биосинтетичким генским кластерима („Цандидатус Еудормицробиацеае“) који су припадали некултивисаном бактеријском типу и укључивали неке од биосинтетички најразноврснијих микроорганизама у овом окружењу.Од њих смо окарактерисали путеве фосфатазе-пептида и питонамида, идентификујући случајеве необичне структуре биоактивног једињења и ензимологије, респективно.У закључку, ова студија показује како стратегије засноване на микробиому могу омогућити истраживање претходно неописаних ензима и природне хране у слабо схваћеној микробиоти и окружењу.
Микроби покрећу глобалне биогеохемијске циклусе, одржавају мреже хране и одржавају здравље биљака и животиња5.Њихова огромна филогенетска, метаболичка и функционална разноликост представља богат потенцијал за откривање нових таксона1, ензима и биохемијских једињења, укључујући природне производе6.У еколошким заједницама, ови молекули обезбеђују микроорганизмима различите физиолошке и еколошке функције, од комуникације до такмичења 2, 7 .Поред својих првобитних функција, ови природни производи и њихови генетски кодирани производни путеви дају примере за биотехнолошку и терапеутску примену2,3.Идентификација таквих путева и веза је у великој мери олакшана проучавањем култивисаних микроба.Међутим, таксономска истраживања природног окружења су показала да велика већина микроорганизама није култивисана8.Ова културолошка пристрасност ограничава нашу способност да искористимо функционалну разноликост коју кодирају многи микроби4,9.
Да би се превазишла ова ограничења, технолошки напредак у протеклој деценији омогућио је истраживачима да директно (тј. без претходне културе) секвенцирају микробне ДНК фрагменте из читавих заједница (метагеномика) или појединачних ћелија.Способност састављања ових фрагмената у веће фрагменте генома и реконструкције вишеструких метагеномски састављених генома (МАГ) или појединачних амплификованих генома (САГ), респективно, отвара важну прилику за таксоцентричне студије микробиома (тј. микробних заједница и микробиома).трасирати нове путеве.сопствени генетски материјал у датој средини) 10,11,12.Заиста, недавне студије су у великој мери прошириле филогенетску репрезентацију микробне разноликости на Земљи1, 13 и откриле су велики део функционалне разноликости у појединачним микробним заједницама које раније нису биле покривене секвенцама референтног генома култивисаних микроорганизама (РЕФ)14.Способност постављања неоткривене функционалне разноликости у контекст генома домаћина (тј. резолуција генома) је критична за предвиђање још некарактеристичних микробних линија које вероватно кодирају нове природне производе15,16 или за праћење таквих једињења до њиховог првобитног произвођача17.На пример, комбиновани приступ метагеномске и једноћелијске геномске анализе довео је до идентификације Цандидатус Ентотхеонелла, групе метаболички богатих бактерија повезаних са сунђером, као произвођача различитих потенцијала лекова18.Међутим, упркос недавним покушајима геномског истраживања различитих микробних заједница,16,19 још увек недостаје више од две трећине глобалних метагеномских података за највећи океан екосистема на Земљи16,20.Дакле, генерално, биосинтетички потенцијал морског микробиома и његов потенцијал као складишта нових ензимских и природних производа остају у великој мери недовољно проучени.
Да бисмо истражили биосинтетички потенцијал морских микробиома на глобалном нивоу, прво смо објединили морске микробне геноме добијене коришћењем метода које зависе од културе и некултуре да бисмо створили опсежну базу података о филогенетици и функцији гена.Испитивање ове базе података открило је широк спектар биосинтетичких генских кластера (БГЦ), од којих већина припада још неокарактерисаним породицама генских кластера (ГЦФ).Поред тога, идентификовали смо непознату породицу бактерија која показује највећу познату разноликост БГЦ-а у отвореном океану до сада.Одабрали смо два пута рибозомске синтезе и пост-транслационо модификованих пептидних (РиПП) пута за експерименталну валидацију на основу њихових генетских разлика од тренутно познатих путева.Функционална карактеризација ових путева је открила неочекиване примере ензимологије, као и структурно необична једињења са инхибиторном активношћу протеазе.
У почетку смо имали за циљ да створимо глобални извор података за анализу генома, фокусирајући се на његове бактеријске и археалне компоненте.У ту сврху, прикупили смо метагеномске податке и 1038 узорака морске воде са 215 глобално дистрибуираних локација за узорковање (распон географске ширине = 141,6°) и неколико дубоких слојева (од 1 до 5600 м у дубину, који покривају пелагичну, мезопелагичну и понорну зону).Позадина 21, 22, 23 (слика 1а, проширени подаци, слика 1а и додатна табела 1).Поред пружања широке географске покривености, ови селективно филтрирани узорци су нам омогућили да упоредимо различите компоненте морског микробиома, укључујући богате вирусима (<0,2 µм), богате прокариотима (0,2-3 µм), богате честицама (0,8 µм). ).–20 µм) и колоније осиромашене вирусом (>0,2 µм).
а, Укупно 1038 јавно доступних генома (метагеномика) морских микробних заједница прикупљених са 215 глобално дистрибуираних локација (62°С до 79°Н и 179°В до 179°Е).Плочице мапе © Есри.Извори: ГЕБЦО, НОАА, ЦХС, ОСУ, УНХ, ЦСУМБ, Натионал Геограпхиц, ДеЛорме, НАВТЕК и Есри.б, ови метагеноми су коришћени за реконструкцију МАГ-ова (методе и додатне информације), који се разликују по количини и квалитету (методе) у скуповима података (означени бојом).Реконструисани МАГ-ови су допуњени јавно доступним (спољним) геномима, укључујући ручно израђене МАГ26, САГ27 и РЕФ.27 Саставите ОМД.ц, у поређењу са претходним извештајима заснованим само на САГ (ГОРГ)20 или МАГ (ГЕМ)16, ОМД побољшава геномску карактеризацију морских микробних заједница (метагеномска стопа мапирања читања; метода) за два до три пута са конзистентнијом заступљеношћу у дубини и географска ширина..<0,2, н=151, 0,2-0,8, н=67, 0,2-3, н=180, 0,8-20, н=30, >0,2, н=610, <30°, н = 132, 30–60° , н = 73, >60°, н = 42, ЕПИ, н = 174, МЕС, н = 45, БАТ, н = 28. д, ОМД груписање у кластере врста (95% средњи нуклеотидни идентитет) идентификује укупно приближно 8300 врста, од којих више од половине није раније окарактерисано према таксономским напоменама користећи ГТДБ (верзија 89) е, класификација врста према типу генома показала је да се МАГ, САГ и РЕФ међусобно добро надопуњују у одражавању филогенетске разноликости морски микробиом.Конкретно, 55%, 26% и 11% врста било је специфично за МАГ, САГ и РЕФ, респективно.БАТС, Бермуда Атлантиц Тиме Сериес;ГЕМ, геноми Земљиног микробиома;ГОРГ, глобални референтни геном океана;ХОТ, временска серија Хаваског океана.
Користећи овај скуп података, реконструисали смо укупно 26.293 МАГ-а, углавном бактеријских и археалних (слика 1б и проширени подаци, слика 1б).Направили смо ове МАГ-ове од склопова из одвојених, а не из скупних метагеномских узорака да бисмо спречили колапс варијације природних секвенци између узорака са различитих локација или временских тачака (метода).Поред тога, груписали смо геномске фрагменте на основу њихове корелације преваленције у великом броју узорака (од 58 до 610 узорака, у зависности од истраживања; методе).Открили смо да је ово дуготрајан, али важан корак24 који је прескочен у неколико великих радова на реконструкцији МАГ16, 19, 25 и значајно побољшава квантитет (2,7 пута у просеку) и квалитет (+20% у просеку) геном.реконструисан из овде проучаваног морског метагенома (проширени подаци, слика 2а и додатне информације).Све у свему, ови напори су довели до 4,5 пута повећања у морским микробним МАГ-овима (6 пута ако се узму у обзир само висококвалитетни МАГ-ови) у поређењу са најсвеобухватнијим МАГ ресурсом који је данас доступан16 (Методе).Овај новостворени МАГ сет је затим комбинован са 830 ручно одабраних МАГ26, 5969 САГ27 и 1707 РЕФ.Двадесет седам врста морских бактерија и археја чинило је комбинаторну колекцију од 34.799 генома (слика 1б).
Затим смо проценили новостворени ресурс како бисмо побољшали његову способност да представља морске микробне заједнице и проценили утицај интеграције различитих типова генома.У просеку смо открили да покрива приближно 40-60% морских метагеномских података (Слика 1ц), што је два до три пута већа покривеност претходних извештаја само за МАГ иу дубини иу географској ширини Море сериал 16 или САГ20.Поред тога, да бисмо систематски измерили таксономску разноликост у успостављеним колекцијама, обележили смо све геноме користећи комплет алата (методе) базе података таксономије генома (ГТДБ) и користили просечан нуклеотидни идентитет за читав геном од 95%.28 да идентификује 8.304 кластера врста (врста).Две трећине ових врста (укључујући нове кладе) се раније нису појављивале у ГТДБ, од којих је 2790 откривено коришћењем МАГ-а реконструисаног у овој студији (слика 1д).Поред тога, открили смо да су различити типови генома веома комплементарни: 55%, 26% и 11% врста се у потпуности састоји од МАГ, САГ и РЕФ (слика 1е).Поред тога, МАГ је покрио свих 49 типова пронађених у воденом стубу, док су САГ и РЕФ представљали само 18, односно 11 типова.Међутим, САГ боље представља разноврсност најчешћих клада (проширени подаци, слика 3а), као што су Пелагиц Бацтериалес (САР11), при чему САГ покрива скоро 1300 врста, а МАГ само 390 врста.Приметно је да су се РЕФ ретко преклапали са МАГ или САГ на нивоу врсте и представљали су >95% од приближно 1000 генома који нису пронађени у метагеномским скуповима отвореног океана који су овде проучавани, углавном због интеракције са другим типовима изолованих репрезентативних морских примерака (нпр. седименти) .или домаћин-сарадник).Да би био широко доступан научној заједници, овај ресурс морског генома, који такође укључује некласификоване фрагменте (нпр. из предвиђених фага, геномских острва и фрагмената генома за које нема довољно података за МАГ реконструкцију), може се упоредити са таксономским подацима .Приступите напоменама заједно са функцијом гена и контекстуалним параметрима у бази података о микробиологији океана (ОМД; хттпс://мицробиомицс.ио/оцеан/).
Затим смо кренули да истражимо богатство и новину биосинтетског потенцијала у микробиомима отвореног океана.У ту сврху, прво смо користили антиСМАСХ за све МАГ-ове, САГ-ове и РЕФ-ове пронађене у 1038 морских метагенома (метода) да бисмо предвидели укупно 39.055 БГЦ-а.Затим смо их груписали у 6907 нередундантних ГЦФ-а и 151 популацију кластера гена (ГЦЦ; Додатна табела 2 и методе) да бисмо узели у обзир инхерентну редундантност (тј. исти БГЦ може бити кодиран у више генома) и метагеномске податке Фрагментација концентрисаних БГЦ-а.Непотпуни БГЦ-ови нису значајно повећали, ако их има (додатне информације), број ГЦФ-а и ГЦЦ-а, респективно, који садрже најмање једног нетакнутог члана БГЦ-а у 44% и 86% случајева.
На нивоу ГЦЦ-а, пронашли смо широк спектар предвиђених РиПП-ова и других природних производа (слика 2а).Међу њима, на пример, арилполиени, каротеноиди, ектоини и сидерофори припадају ГЦЦ са широком филогенетском дистрибуцијом и великим обиљем у океанским метагеномима, што може указивати на широку адаптацију микроорганизама на морску средину, укључујући отпорност на реактивне врсте кисеоника, оксидативни и осмотски стрес..или апсорпција гвожђа (више информација).Ова функционална разноликост је у супротности са недавном анализом од приближно 1,2 милиона БГЦ-а међу приближно 190.000 генома похрањених у бази података НЦБИ РефСек (БиГ-ФАМ/РефСек, у даљем тексту РефСек)29, која је показала да нерибозомални синтетазни пептиди попептидазе (НРПС) (ПКС) БГЦ (додатне информације).Такође смо пронашли 44 (29%) ГЦЦ-а који су само у даљини повезани са било којим РефСек БГЦ (\(\бар{д}\)РефСек > 0,4; слика 2а и методе) и 53 (35%) ГЦЦ-а само у МАГ-у, наглашавајући потенцијал за откривање претходно неописаних хемикалија у ОМД.С обзиром да сваки од ових ГЦЦ-а вероватно представља веома различите биосинтетичке функције, даље смо анализирали податке на нивоу ГЦФ-а у настојању да обезбедимо детаљније груписање БГЦ-а за које је предвиђено да кодирају сличне природне производе29.Укупно 3861 (56%) идентификованих ГЦФ-ова није се преклапало са РефСек-ом, а >97% ГЦФ-а није било присутно у МИБиГ-у, једној од највећих база података експериментално потврђених БГЦ-а (Слика 2б).Иако није изненађујуће открити многе потенцијалне нове путеве у окружењима која нису добро представљена референтним геномом, наш метод за дерепликацију БГЦ-а у ГЦФ-ове пре бенчмаркинга се разликује од претходних извештаја 16 и омогућава нам да пружимо непристрасну процену новости.Већина новог диверзитета (3012 ГЦФ или 78%) одговара предвиђеним терпенима, РиПП или другим природним производима, а већина (1815 ГЦФ или 47%) је кодирана у непознатим типовима због њиховог биосинтетичког потенцијала.За разлику од ПКС и НРПС кластера, мање је вероватно да ће ови компактни БГЦ-и бити фрагментисани током метагеномског склапања 31 и омогућавају функционалну карактеризацију њихових производа која захтева више времена и ресурса.
Укупно 39.055 БГЦ-ова груписано је у 6.907 ГЦФ-а и 151 ГЦЦ-а.а, представљање података (интерно екстерно).Хијерархијско груписање БГЦ растојања засновано на ГЦЦ, од којих 53 фиксира само МАГ.ГЦЦ садржи БГЦ из различитих таксона (лн-трансформисана фреквенција капије) и различитих БГЦ класа (величина круга одговара његовој фреквенцији).За сваки ГЦЦ, спољни слој представља број БГЦ-ова, преваленцију (проценат узорака) и растојање (минимална БГЦ косинусна удаљеност (мин(дМИБиГ))) од БиГ-ФАМ до БГЦ.ГЦЦ са БГЦ-овима који су блиско повезани са експериментално верификованим БГЦ-има (МИБиГ) су означени стрелицама.б Упоређујући ГЦФ са предвиђеним (БиГ-ФАМ) и експериментално потврђеним (МИБиГ) БГЦс, пронађено је 3861 нових (д–>0,2) ГЦФ.Већина (78%) ових кодова за РиПП, терпене и друге наводне природне производе.ц, сви геноми у ОМД пронађени у 1038 морских метагенома су смештени у ГТДБ базно стабло да би показали филогенетску покривеност ОМД-а.Кладе без икаквих генома у ОМД-у су приказане сивом бојом.Број БГЦ-а одговара највећем броју предвиђених БГЦ-а по геному у датој клади.Ради јасноће, последњих 15% чворова је срушено.Стрелице означавају кладе богате БГЦ (>15 БГЦ), са изузетком Мицобацтериум, Гордониа (други само Рходоцоццус) и Цроцоспхаера (други само Синецхоцоццус).д, непознато ц.Еремиобацтерота је показала највећу биосинтетичку разноврсност (Шенонов индекс заснован на типу природног производа).Свака трака представља геном са највише БГЦ у врсти.Т1ПКС, ПКС тип И, Т2/3ПКС, ПКС тип ИИ и тип ИИИ.
Поред богатства и новине, истражујемо биогеографску структуру биосинтетичког потенцијала морског микробиома.Груписање узорака према просечној метагеномској расподели броја копија ГЦФ (Методе) показало је да су заједнице ниске географске ширине, површине, прокариотски богате и сиромашне вирусима, углавном из површинских или дубљих вода обасјаних сунцем, биле богате РиПП и БГЦ терпенима.Насупрот томе, поларне, дубокоморске заједнице богате вирусима и честицама биле су повезане са већом заступљеношћу НРПС и ПКС БГЦ (проширени подаци, слика 4 и додатне информације).Коначно, открили смо да су добро проучене тропске и пелагичне заједнице извори нових терпена који највише обећавају (слика проширених података).Највећи потенцијал за ПКС, РиПП и друге природне производе (слика 5а са проширеним подацима).
Да бисмо допунили нашу студију о биосинтетичком потенцијалу морских микробиома, имали смо за циљ да мапирамо њихову филогенетичку дистрибуцију и идентификујемо нове кладе обогаћене БГЦ-ом.У ту сврху, поставили смо геноме морских микроба у нормализовано ГТДБ13 бактеријско и археално филогенетско стабло и преклопили претпостављене биосинтетичке путеве које они кодирају (слика 2ц).Лако смо открили неколико клада обогаћених БГЦ-ом (представљених са преко 15 БГЦ-а) у узорцима морске воде (методе) познатим по свом биосинтетском потенцијалу, као што су цијанобактерије (Синецхоцоццус) и бактерије Протеус, као што је Тистрелла32,33, или су недавно привукле пажњу својим природни производи.као што су Микоцоццота (Сандарацинацеае), Рходоцоццус и Планцтомицетота34,35,36.Занимљиво је да смо у овим кладама пронашли неколико раније неистражених линија.На пример, оне врсте са најбогатијим биосинтетичким потенцијалом у типу Планцтомицетота и Микоцоццота припадале су некарактеристичним кандидатским редовима и родовима (додатна табела 3).Узето заједно, ово сугерише да ОМД пружа приступ раније непознатим филогенетским информацијама, укључујући микроорганизме, који могу представљати нове мете за откривање ензима и природних производа.
Затим смо окарактерисали кладу обогаћену БГЦ-ом не само бројањем максималног броја БГЦ-ова које су кодирали њени чланови, већ и проценом разноликости ових БГЦ-ова, што објашњава учесталост различитих типова природних производа кандидата (слика 2ц и методе )..Открили смо да су биосинтетички најразноврсније врсте представљене специјално пројектованим бактеријским МАГ-овима у овој студији.Ове бактерије припадају некултивисаном типу Цандидатус Еремиобацтерота, који остаје углавном неистражен осим неколико геномских студија37,38.Важно је напоменути да „ца.Род Еремиобацтерота је анализиран само у копненом окружењу39 и није познато да укључује чланове обогаћене БГЦ-ом.Овде смо реконструисали осам МАГ-ова исте врсте (идентитет нуклеотида > 99%) 23. Стога предлажемо назив врсте „Цандидатус Еудремицробиум маласпинии“, назван по нереиди (морска нимфа), прелепом дару у грчкој митологији и експедицијама.'Ка.Према филогенетској анотацији 13, Е. маласпинии нема раније познатих рођака испод нивоа секвенце и стога припада новој бактеријској породици за коју предлажемо „Ца.Е. маласпинии“ као типска врста и „Ца.Еудормицробиацеае” као службени назив (додатне информације).Кратка метагеномска реконструкција 'Ца.Пројекат генома Е. маласпинии је потврђен веома малим уносом, дуго читаним метагеномским секвенцирањем и циљаним састављањем једног узорка (Методе) као једног линеарног хромозома од 9,63 Мб са дупликацијом од 75 кб.као једина преостала нејасноћа.
Да бисмо утврдили филогенетски контекст ове врсте, тражили смо 40 блиско повезаних врста у додатним метагеномским узорцима обогаћеним еукариотима из експедиције на Тари океан кроз циљану реконструкцију генома.Укратко, повезали смо метагеномска читања са геномским фрагментима повезаним са „Ца.Е. маласпинии” и претпоставио да повећана стопа регрутовања у овом узорку указује на присуство других сродника (методе).Као резултат тога, пронашли смо 10 МАГ-ова, комбинацију 19 МАГ-ова који представљају пет врста у три рода у оквиру новодефинисане породице (тј. „Ца. Еудормицробиацеае“).Након ручне провере и контроле квалитета (проширени подаци, сл. 6 и додатне информације), установили смо да је „Ца.Врсте Еудормицробиацеае имају веће геноме (8 Мб) и богатији биосинтетички потенцијал (14 до 22 БГЦ по врсти) од осталих чланова „Ца“.Цладе Еремиобацтерота (до 7 БГЦ) (сл. 3а–ц).
а, Филогенетски положаји пет 'Ца.Врсте Еудормицробиацеае показале су богатство БГЦ специфично за морске линије идентификоване у овој студији.Филогенетско стабло укључује све 'Ца.МАГ Еремиобацтерота и чланови других фила (бројеви генома у заградама) дати у ГТДБ (верзија 89) коришћени су за еволуциону позадину (Методе).Најудаљенији слојеви представљају класификације на нивоу породице („Ца. Еудормицробиацеае” и „Ца. Ксенобиацеае”) и на нивоу класе („Ца. Еремиобацтериа”).Пет врста описаних у овој студији представљено је алфанумеричким кодовима и предложеним биномским именима (додатне информације).б, ок.Врсте Еудормицробиацеае деле седам заједничких БГЦ језгара.Одсуство БГЦ-а у клади А2 настало је због непотпуности репрезентативног МАГ-а (додатна табела 3).БГЦ-ови су специфични за „Ца.Ампхитхомицробиум“ и „Ца.Ампхитхомицробиум” (кладови А и Б) нису приказани.ц, Сви БГЦ-ови кодирани као „Ца.Утврђено је да је Еудремицробиум тараоцеании изражен у 623 метатранскриптома узетих из океана Таре.Пуни кругови означавају активну транскрипцију.Наранџасти кругови означавају лог2-трансформисане промене набора испод и изнад стопе експресије гена за домаћинство (методе).д, криве релативног обиља (методе) које показују 'Ца.Врсте Еудормицробиацеае су распрострањене у већини океанских басена и у целом воденом стубу (од површине до дубине од најмање 4000 м).На основу ових процена, установили смо да је 'Ца.Е. маласпинии' чини до 6% прокариотских ћелија у дубокоморским пелагијским заједницама које су повезане са житарицама.Сматрали смо да је врста присутна на локацији ако је пронађена у било ком делу величине датог дубинског слоја.ИО – Индијски океан, НАО – Северни Атлантик, НПО – Северни Пацифик, РС – Црвено море, САО – Јужни Атлантик, СО – Јужни океан, СПО – Јужни Пацифик.
Проучавајући обиље и дистрибуцију Ца.Еудормицробиацеае, која, како смо утврдили, доминира у већини океанских басена, као и у целом воденом стубу (Сл. 3д).Локално, они чине 6% морске микробне заједнице, што их чини важним делом глобалног морског микробиома.Поред тога, пронашли смо релативни садржај Ца.Врсте Еудормицробиацеае и нивои њихове експресије БГЦ били су највиши у фракцији обогаћеној еукариотима (слика 3ц и проширени подаци, слика 7), што указује на могућу интеракцију са честицама, укључујући планктон.Ово запажање има неке сличности са 'Ца.Еудремицробиум БГЦ-и који производе цитотоксичне природне производе познатим путевима могу показати предаторско понашање (додатне информације и проширени подаци, слика 8), слично другим грабежљивцима који специфично производе метаболите као што је Микоцоццус41.Откриће Ца.Еудормицробиацеае у мање доступним (дубоки океан) или еукариотским, а не прокариотским узорцима могу објаснити зашто ове бактерије и њихова неочекивана разноликост БГЦ остају нејасни у контексту истраживања природне хране.
На крају, покушали смо да експериментално потврдимо обећање нашег рада заснованог на микробиому у откривању нових путева, ензима и природних производа.Међу различитим класама БГЦ-а, познато је да РиПП пут кодира богату хемијску и функционалну разноликост због различитих пост-транслационих модификација језгра пептида од стране зрелих ензима42.Зато смо изабрали два 'Ца.Еудоремицробиум' РиПП БГЦ (Слике 3б и 4а-е) су засноване на истом као и било који познати БГЦ (\(\бар{д}\)МИБиГ и \(\бар{д}\)РефСек изнад 0,2).
а–ц, Ин витро хетерологна експресија и ин витро ензимски тестови новог (\(\бар{д}\)РефСек = 0,29) кластера биосинтезе РиПП специфичне за дубокоморске врсте Ца.Е. маласпинии' довела је до производње дифосфорилираних производа.ц, модификације идентификоване коришћењем МС/МС високе резолуције (ХР) (фрагментација означена б и и јонима у хемијској структури) и НМР (проширени подаци, слика 9).д, овај фосфориловани пептид показује ниску микромоларну инхибицију неутрофилне еластазе сисара, која се не налази у контролном пептиду и дехидрирајућем пептиду (дехидрација изазвана хемијским уклањањем).Експеримент је поновљен три пута са сличним резултатима.На пример, хетерологна експресија другог новог \(\бар{д}\)РефСек = 0,33) кластера биосинтезе протеина разјашњава функцију четири зрела ензима који модификују језгро пептида од 46 аминокиселина.Остаци су обојени према месту модификације предвиђеном ХР-МС/МС, обележавањем изотопа и НМР анализом (додатне информације).Испрекидана боја указује да се модификација дешава на било ком од два остатка.Слика је компилација бројних хетерологних конструката који показују активност свих зрелих ензима на истом језгру.х, Илустрација НМР података за Н-метилацију амида кичме.Пуни резултати су приказани на сл.10 са проширеним подацима.и, Филогенетски положај ензима кластера зрелог протеина ФкбМ међу свим ФкбМ доменима пронађеним у бази података МИБиГ 2.0 открива ензим ове породице са активношћу Н-метилтрансферазе (додатне информације).Приказани су шематски дијаграми БГЦ (а, е), прекурсорских пептидних структура (б, ф) и претпостављених хемијских структура природних производа (ц, г).
Први пут РиПП-а (\(\бар{д}\)МИБиГ = 0,41, \(\бар{д}\)РефСек = 0,29) пронађен је само код дубокоморских врста „Ца.Е. маласпинии” и кодови за Пептиде-прекурсор (слика 4а, б).У овом зрелом ензиму, идентификовали смо један функционални домен хомологан домену дехидратације лантипептид синтазе који нормално катализира фосфорилацију и накнадно уклањање 43 (додатне информације).Стога предвиђамо да модификација прекурсора пептида укључује такву дехидратацију у два корака.Међутим, коришћењем тандем масене спектрометрије (МС/МС) и спектроскопије нуклеарне магнетне резонанце (НМР), идентификовали смо полифосфориловани линеарни пептид (слика 4ц).Иако неочекивано, пронашли смо неколико линија доказа који подржавају да је то крајњи производ: два различита хетерологна домаћина и без дехидрације у ин витро тестовима, идентификација кључних остатака мутираних на месту каталитичке дехидратације зрелог ензима.све је реконструисао „Ца“.Геном Е. маласпинии (проширени подаци, слика 9 и додатне информације) и, коначно, биолошка активност фосфорилисаног производа, али не и хемијски синтетизованог дехидрираног облика (слика 4д).У ствари, открили смо да показује ниску микромоларну инхибиторну активност протеазе против неутрофилне еластазе, упоредиву са другим сродним природним производима у опсегу концентрација (ИЦ50 = 14,3 μМ) 44 , упркос чињеници да еколошка улога тек треба да се разјасни.На основу ових резултата, предлажемо да се пут назове „фосфептин“.
Други случај је сложен РиПП пут специфичан за 'Ца.Предвиђено је да род Еудремицробиум (\(\бар{д}\)МИБиГ = 0,46, \(\бар{д}\)РефСек = 0,33) кодира природне протеинске производе (слика 4е).Ови путеви су од посебног биотехнолошког интереса због очекиване густине и разноврсности необичних хемијских модификација које успостављају ензими кодирани релативно кратким БГЦс45.Открили смо да се овај протеин разликује од претходно окарактерисаних протеина по томе што му недостаје и главни НКС5Н мотив полицерамида и лантионинска петља ландорнамида 46 .Да бисмо превазишли ограничења уобичајених хетерологних образаца експресије, користили смо их заједно са прилагођеним Мицровиргула аероденитрифицанс системом за карактеризацију четири зрела ензима (метода).Користећи комбинацију МС/МС, обележавања изотопа и НМР, открили смо ове зреле ензиме у језгру пептида од 46 аминокиселина (слика 4ф,г, проширени подаци, слике 10–12 и додатне информације).Међу зрелим ензимима, окарактерисали смо прво појављивање члана породице ФкбМ О-метилтрансферазе 47 у РиПП путу и ​​неочекивано открили да овај зрели ензим уводи Н-метилацију кичме (слика 4х, и и додатне информације).Иако је ова модификација позната у природним НРП48 производима, ензимска Н-метилација амидних веза је сложена, али биотехнолошки значајна реакција49 која је до сада била од интереса за РиПП фамилију борозина.Специфичност 50,51.Идентификација ове активности у другим породицама ензима и РиПП-а може отворити нове примене и проширити функционалну разноликост протеина 52 и њихову хемијску разноликост.На основу идентификованих модификација и необичне дужине предложене структуре производа, предлажемо назив пута „питонамид“.
Откриће неочекиване ензимологије у функционално окарактерисаној породици ензима илуструје обећање геномике животне средине за нова открића, а такође илуструје ограничен капацитет за функционално закључивање само на основу хомологије секвенце.Стога, заједно са извештајима о неканонским биоактивним полифосфорилисаним РиПП-овима, наши резултати показују ресурсно интензивну, али критичну вредност за напоре синтетичке биологије да се у потпуности открије функционално богатство, разноликост и необичне структуре биохемијских једињења.
Овде демонстрирамо опсег биосинтетичког потенцијала који кодирају микроби и њихов геномски контекст у глобалном морском микробиому, олакшавајући будућа истраживања тако што ће резултирајући ресурс учинити доступним научној заједници (хттпс://мицробиомицс.ио/оцеан/).Открили смо да се већи део његове филогенетске и функционалне новине може добити само реконструкцијом МАГ-ова и САГ-ова, посебно у недовољно искоришћеним микробним заједницама које би могле да усмере будуће напоре у биопроспекцији.Иако ћемо се овде фокусирати на 'Ца.Еудормицробиацеае” као лоза посебно биосинтетички „талентована”, многи од БГЦ-а предвиђених у неоткривеној микробиоти вероватно кодирају претходно неописане ензимологије које дају једињења са еколошки и/или биотехнолошки значајним деловањем.
Метагеномски скупови података из главних океанографских и студија временских серија са довољном дубином секвенцирања су укључени да би се максимизирала покривеност глобалних морских микробних заједница у океанским басенима, дубоким слојевима и током времена.Ови скупови података (додатна табела 1 и слика 1) укључују метагеномику узорака прикупљених у океанима Таре (обогаћени вирусима, н=190; прокариотски обогаћени, н=180)12,22 и експедицију БиоГЕОТРАЦЕС (н=480).Хавајски океански временски низ (ХОТ, н = 68), бермудско-атлантски временски низ (БАТС, н = 62)21 и експедиција Маласпина (н = 58)23.Читања секвенционирања из свих метагеномских фрагмената су филтрирана за квалитет коришћењем ББМап-а (в.38.71) уклањањем адаптера секвенцирања из читања, уклањањем читања мапираних у секвенце контроле квалитета (ПхиКс геноми) и коришћењем тримк=14, мак=20 одбацује лош квалитет читања, макнс = 0 и минленгтх = 45. Наредне анализе су покренуте или спојене са КЦ читањима ако је наведено (ббмерге.сх миноверлап=16).КЦ очитавања су нормализована (ббнорм.сх циљ = 40, дубина ума = 0) пре изградње помоћу метаСПАдес (в.3.11.1 или в.3.12 ако је потребно)53.Добијени контигови скеле (у даљем тексту скеле) су коначно филтрирани по дужини (≥1 кб).
1038 метагеномских узорака је подељено у групе, а за сваку групу узорака, очитавања метагеномске контроле квалитета свих узорака су усклађена са заградама сваког узорка посебно, што је резултирало следећим бројем групних читања у парним заградама: Морски вируси Тара – обогаћени (190×190), Прокариоти обогаћени (180×180), БиоГЕОТРАЦЕС, ХОТ и БАТС (610×610) и Маласпина (58×58).Мапирање је урађено коришћењем Бурровс-Вхеелер-Алигнер-а (БВА) (в.0.7.17-р1188)54 који омогућава да се очитавања упореде са секундарним локацијама (користећи -а заставицу).Поравнања су филтрирана тако да буду дугачка најмање 45 база, имају ≥97% идентитета и распон ≥80% читања.Добијене БАМ датотеке су обрађене коришћењем скрипте јги_суммаризе_бам_цонтиг_дептхс за МетаБАТ2 (в.2.12.1)55 да би се обезбедила покривеност унутар и између узорка за сваку групу.Коначно, заграде су груписане да би се повећала осетљивост појединачним покретањем МетаБАТ2 на свим узорцима са –минЦонтиг 2000 и –макЕдгес 500. Користимо МетаБАТ2 уместо ансамбл боксера јер се у независним тестовима показало да је најефикаснији појединачни боксер.и 10 до 50 пута бржи од других уобичајено коришћених боксера57.Да би се тестирао ефекат корелације обиља, насумично одабрани подузорак метагеномике (10 за сваки од два скупа података о океану Тара, 10 за БиоГЕОТРАЦЕС, 5 за сваку временску серију и 5 за Маласпину) додатно је користио само узорке.Интерни узорци су груписани да би се добиле информације о покривености.(Додатне Информације).
Додатни (спољни) геноми су укључени у каснију анализу, наиме 830 ручно одабраних МАГ-ова из подскупа скупа података Тара Оцеанс26, ​​5287 САГ-ова из скупа података ГОРГ20 и подаци из МАР базе података (МарДБ в. 4) из 1707 изолованих РЕФ-а и 682 САГс) 27. За МарДБ скуп података, геноми се бирају на основу доступних метаподатака ако тип узорка одговара следећем регуларном изразу: '[С|с]сингле.?[Ц|ц]елл|[Ц|ц]ултуре| [И|и] изолован'.
Квалитет сваког метагеномског контејнера и екстерних генома је процењен коришћењем ЦхецкМ (в.1.0.13) и Анви'о Линеаге Воркфлов (в.5.5.0)58,59.Ако ЦхецкМ или Анви'о прикажу ≥50% потпуности/потпуности и ≤10% контаминације/редунданције, онда сачувајте метагеномске ћелије и екстерне геноме за каснију анализу.Ови резултати су затим комбиновани у средњу потпуност (мцпл) и средњу контаминацију (мцтн) да би се класификовао квалитет генома према критеријумима заједнице60 на следећи начин: висок квалитет: мцпл ≥ 90% и мцтн ≤ 5%;добар квалитет: мцпл ≥ 70%, мцтн ≤ 10%, средњи квалитет: мцпл ≥ 50% и мцтн ≤ 10%, поштен квалитет: мцпл ≤ 90% или мцтн ≥ 10%.Филтрирани геноми су затим у корелацији са оценама квалитета (К и К') на следећи начин: К = мцпл – 5 к мцтн К' = мцпл – 5 к мцтн + мцтн к (варијабилност соја)/100 + 0,5 к лог[Н50] .(примењено у дРеп61).
Да би се омогућила компаративна анализа између различитих извора података и типова генома (МАГ, САГ и РЕФ), 34.799 генома је дереференцирано на основу просечног нуклеотидног идентитета у целом геному (АНИ) коришћењем дРеп (в.2.5.4).Понавља)61 са 95% АНИ прагова28,62 (-цомп 0 -цон 1000 -са 0,95 -нц 0,2) и маркерски гени у једној копији који користе СпецИ63 који обезбеђују груписање генома на нивоу врсте.Репрезентативни геном је одабран за сваки дРеп кластер у складу са максималним резултатом квалитета (К') дефинисаним горе, који се сматра репрезентативним за врсту.
За процену брзине мапирања, БВА (в.0.7.17-р1188, -а) је коришћен за мапирање свих 1038 сетова метагеномских очитавања са 34,799 генома садржаних у ОМД-у.Читања која су контролисана квалитетом су мапирана у једностраном режиму, а резултујућа поравнања су филтрирана да би се задржала само поравнања дужине ≥45 бп.и идентитет ≥95%.Однос приказа за сваки узорак је проценат очитавања преосталих након филтрације подељен укупним бројем очитавања контроле квалитета.Користећи исти приступ, сваки од 1038 метагенома је смањен на 5 милиона уметака (проширени подаци, слика 1ц) и усклађен са ГОРГ САГ у ОМД-у и у свим ГЕМ16.Количина МАГ-ова добијених из морске воде у ГЕМ16 каталогу одређена је упитима кључних речи метагеномских извора, одабиром узорака морске воде (нпр. за разлику од морских седимената).Конкретно, бирамо „водени“ као „категорија_екосистема“, „морски“ као „тип_екосистема“ и филтрирамо „станиште“ као „дубоки океан“, „морски“, „поморски океански“, „пелагични морски“, „морска вода“ , „Океан“, „Морска вода“, „Површинска морска вода“, „Површинска морска вода“.Ово је резултирало са 5903 МАГ-а (734 високог квалитета) дистрибуираних преко 1823 ОТУ-а (погледајте овде).
Прокариотски геноми су таксономски означени коришћењем ГТДБ-Тк (в.1.0.2)64 са подразумеваним параметрима који циљају ГТДБ р89 верзију 13. Анви'о је коришћен за идентификацију еукариотских генома на основу предвиђања домена и опозива ≥50% и редундантности ≤ %.Таксономска ознака врсте је дефинисана као један од њених репрезентативних генома.Са изузетком еукариота (148 МАГ), сваки геном је прво функционално обележен коришћењем прокке (в.1.14.5)65, именовањем комплетних гена, дефинисањем параметара „археје“ или „бактерије“ по потреби, што је такође пријављено за не- кодирајући гени.и ЦРИСПР региони, између осталих геномских карактеристика.Означите предвиђене гене идентификацијом универзалних гена маркера са једном копијом (усцМГ) користећи фетцхМГ (в.1.2)66, доделите ортолошке групе и поставите упит помоћу емаппер-а (в.2.0.1)67 на основу еггНОГ (в.5.0)68.КЕГГ база података (објављена 10. фебруара 2020.) 69. Последњи корак је изведен упаривањем протеина са КЕГГ базом података коришћењем ДИАМОНД (в.0.9.30)70 са покривеношћу упита и теме од ≥70%.Резултати су даље филтрирани према НЦБИ каналу за белешке о прокариотском геному71 на основу битрате ≥ 50% од максималног очекиваног битрате-а (сама веза).Генске секвенце су такође коришћене као улаз за идентификацију БГЦ-а у геному коришћењем антиСМАСХ (в.5.1.0)72 са подразумеваним параметрима и различитим експлозијама кластера.Сви геноми и напомене су састављени у ОМД заједно са контекстуалним метаподацима доступним на вебу (хттпс://мицробиомицс.ио/оцеан/).
Слично претходно описаним методама12,22 користили смо ЦД-ХИТ (в.4.8.1) да групишемо >56,6 милиона гена који кодирају протеине из бактеријских и археалних генома из ОМД-а у 95% идентитета и краће гене (90% покривеност)73 до >17,7 милиона кластера гена.Најдужа секвенца је изабрана као репрезентативни ген за сваки кластер гена.1038 метагенома је затим упарено са >17,7 милиона чланова БВА (-а) кластера и резултујуће БАМ датотеке су филтриране да задрже само поравнања са ≥95% процента идентитета и ≥45 основних поравнања.Обиље гена нормализовано по дужини израчунато је прво бројањем уметака из најбољег јединственог поравнања, а затим, за фуззи мапиране уметке, додавањем фракционих бројања одговарајућим циљним генима пропорционално њиховом броју јединствених уметака.
Геноми из проширеног ОМД-а (са додатним МАГ-овима из „Ца. Еудормицробиацеае“, видети доле) додати су у базу података алата за метагеномску анализу мОТУс74 (в.2.5.1) да би се створила проширена референтна база података мОТУ.Само шест генома са једном копијом (23.528 генома) је преживело од десет усцМГ.Проширење базе података резултирало је са 4.494 додатна кластера на нивоу врсте.1038 метагенома је анализирано коришћењем подразумеваних мОТУ параметара (в.2).Укупно 989 генома садржаних у 644 мОТУ кластера (95% РЕФ, 5% САГ и 99,9% припада МарДБ) није откривено мОТУ профилом.Ово одражава различите додатне изворе морске изолације МарДБ генома (већина неоткривених генома је повезана са организмима изолованим из седимената, морским домаћинима, итд.).Да бисмо наставили да се фокусирамо на окружење отвореног океана у овој студији, искључили смо их из низводне анализе осим ако нису откривени или укључени у проширену базу података мОТУ креирану у овој студији.
Сви БГЦ-ови из МАГ, САГ и РЕФ у ОМД-у (види горе) су комбиновани са БГЦ-има идентификованим у свим метагеномским скелама (антиСМАСХ в.5.0, подразумевани параметри) и окарактерисани коришћењем БиГ-СЛИЦЕ (в.1.1) (ПФАМ домен)75.На основу ових карактеристика, израчунали смо све косинусне удаљености између БГЦ-ова и груписали их (средње везе) у ГЦФ и ГЦЦ користећи прагове удаљености од 0,2 и 0,8 респективно.Ови прагови су адаптација прагова који су претходно коришћени коришћењем Еуклидске удаљености75 заједно са косинусном растојањем, што ублажава неке од грешака у оригиналној стратегији груписања БиГ-СЛИЦЕ (додатне информације).
БГЦ-ови су затим филтрирани да би се задржало само ≥5 кб кодираних на скелама да би се смањио ризик од фрагментације као што је претходно описано16 и да би се искључили МарДБ РЕФ-ови и САГ-ови који нису пронађени у 1038 метагенома (види горе).Ово је довело до тога да је укупно 39.055 БГЦ кодираних ОМД геномом, са додатних 14.106 идентификованих на метагеномским фрагментима (тј. нису комбиновани у МАГ).Ови „метагеномски“ БГЦ-и коришћени су за процену удела потенцијала биосинтезе морског микробиома који није ухваћен у бази података (додатне информације).Сваки БГЦ је функционално окарактерисан према предиктивним типовима производа дефинисаним анти-СМАСХ или грубљим категоријама производа дефинисаним у БиГ-СЦАПЕ76.Да би се спречила пристрасност узорковања у квантификацији (таксономски и функционални састав ГЦЦ/ГЦФ, удаљеност ГЦФ и ГЦЦ до референтних база података и метагеномско обиље ГЦФ), задржавањем само најдужег БГЦ по ГЦФ за сваку врсту, 39 055 БГЦ је даље дедуплицирано, што је резултирало укупно 17.689 БГЦ.
Новина ГЦЦ и ГЦФ је процењена на основу удаљености између израчунате базе података (РефСек база података у БиГ-ФАМ)29 и експериментално верификоване (МИБИГ 2.0)30 БГЦ.За сваки од 17.689 репрезентативних БГЦ-а, изабрали смо најмању косинусну удаљеност до одговарајуће базе података.Ове минималне удаљености се затим усредњавају (средња вредност) према ГЦФ или ГЦЦ, према потреби.ГЦФ се сматра новим ако је растојање до базе података веће од 0,2, што одговара идеалном раздвајању између (просечног) ГЦФ-а и референце.За ГЦЦ, бирамо 0,4, што је двоструко више од прага дефинисаног ГЦФ-ом, да бисмо закључали дугорочну везу са везама.
Метагеномско обиље БГЦ-а је процењено као просечна заступљеност његових биосинтетских гена (како је одређено анти-СМАСХ) доступних из профила на нивоу гена.Метагеномско обиље сваког ГЦФ или ГЦЦ је затим израчунато као збир репрезентативних БГЦ (од 17,689).Ове мапе обиља су накнадно нормализоване за ћелијски састав коришћењем броја мОТУ по узорку, што је такође узимало у обзир напоре секвенцирања (проширени подаци, слика 1д).Преваленција ГЦФ или ГЦЦ израчуната је као проценат узорака са обиљем > 0.
Еуклидско растојање између узорака је израчунато из нормализованог ГЦФ профила.Ове удаљености су смањене у величини помоћу УМАП77, а резултујућа уграђивања су коришћена за ненадзирано груписање засновано на густини помоћу ХДБСЦАН78.Оптимални минимални број поена за кластер (а самим тим и број кластера) који ХДБСЦАН користи је одређен максимизирањем кумулативне вероватноће чланства у кластеру.Идентификовани кластери (и насумични избалансирани подузорак ових кластера да би се узела у обзир пристрасност у пермутационој мултиваријантној анализи варијансе (ПЕРМАНОВА)) су тестирани на значај у односу на нередуковане еуклидске удаљености коришћењем ПЕРМАНОВЕ.Просечна величина генома узорака израчуната је на основу релативног обиља мОТУ и процењене величине генома чланова генома.Конкретно, просечна величина генома сваког мОТУ процењена је као просек величина генома његових чланова исправљених за потпуност (након филтрирања) (на пример, 75% комплетан геном дужине 3 Мб има прилагођену величину од 4 Мб).за средње геноме са интегритетом ≥70%.Просечна величина генома за сваки узорак је затим израчуната као збир величина генома мОТУ пондерисаних релативном заступљеношћу.
Филтрирани скуп БГЦ кодираних геномом у ОМД-у приказан је у бактеријским и археалним ГТДБ стаблима (у оквирима од ≥5 кб, искључујући РЕФ и САГ МарДБ који нису пронађени у 1038 метагенома, види горе) и њиховим предвиђеним категоријама производа на основу филогенетике положај генома (види горе).Прво смо смањили податке по врстама, користећи геном са највише БГЦ у тој врсти као репрезентативан.За визуелизацију, представници су даље подељени у групе стабала, и поново, за сваку ћелијску кладу, геном који садржи највећи број БГЦ-а је изабран као представник.Врсте обогаћене БГЦ-ом (најмање један геном са >15 БГЦ-а) су даље анализиране израчунавањем Шеноновог индекса разноликости за типове производа који су кодирани у тим БГЦ-овима.Ако су сви предвиђени типови производа исти, сматра се да хемијски хибриди и други комплексни БГЦ (како предвиђа анти-СМАХ) припадају истом типу производа, без обзира на њихов редослед у групи (нпр. фузија протеин-бактериоцин и бактериоцин-протеопротеин). тело).хибрид).
Преостала ДНК (процењује се да је 6 нг) из Маласпина узорка МП1648, што одговара биолошком узорку САМН05421555 и поклапа се са Иллумина СРР3962772 метагеномским сетом читања за кратко читање, обрађено према ПацБио протоколу секвенцирања са ултра-ниским уносом за употребу ПацБио узорка за употребу ПацБио узорка комплет (100-980-000) и СМРТбелл Екпресс 2.0 комплет за припрему шаблона (100-938-900).Укратко, преостала ДНК је исечена, поправљена и пречишћена (ПроНек перле) коришћењем Цовариса (г-ТУБЕ, 52104).Пречишћена ДНК се затим подвргава припреми библиотеке, амплификацији, пречишћавању (ПроНек перле) и одабиру величине (>6 кб, Блуе Пиппин) пре завршног корака пречишћавања (ПроНек перле) и секвенционирања на платформи Секуел ИИ.
Реконструкција прве две ца.За МАГ Еремиобацтерота, идентификовали смо шест додатних АНИ >99% (ови су укључени на Слици 3), који су првобитно филтрирани на основу резултата контаминације (касније идентификовани као дупликати гена, видети доле).Пронашли смо и послужавник са натписом „Ца“.Еремиобацтерота” из различитих студија23 и користио их заједно са осам МАГ-ова из наше студије као референцу за метагеномска очитавања из 633 узорка обогаћених еукариотима (>0,8 µм) користећи БВА (в.0.7.17) Реф -р1188, – заставицу) за смањење узорковања мапирање (5 милиона читања).На основу мапа специфичних за обогаћивање (филтрираних 95% идентитета поравнања и 80% покривености читањем), 10 метагенома (очекивана покривеност ≥5×) је одабрано за склапање и додатних 49 метагенома (очекивана покривеност ≥1×) за корелацију садржаја.Користећи исте параметре као горе, ови узорци су сакупљени и додато је 10 додатних Ца.МАГ Еремиобацтерота је обновљен.Ових 16 МАГ-ова (не рачунајући два која су већ у бази података) доводи укупан број генома у проширеном ОМД-у на 34.815.МАГ-овима се додељују таксономски рангови на основу њихове геномске сличности и позиције у ГТДБ.18 МАГ-ова је дереплицирано коришћењем дРеп-а у 5 врста (интраспецифични АНИ >99%) и 3 рода (интрагенерички АНИ 85% до 94%) у оквиру исте породице79.Представници врста су ручно одабрани на основу интегритета, контаминације и Н50.Предложена номенклатура је дата у Додатним информацијама.
Процените интегритет и контаминацију 'Ца.МАГ Еремиобацтерота, проценили смо присуство усцМГ, као и скупове маркерских гена специфичних за линију и домене које су користили ЦхецкМ и Анви'о.Идентификација 2 дупликата од 40 усцМГс потврђена је филогенетском реконструкцијом (види доле) да би се искључила свака потенцијална контаминација (ово одговара 5% на основу ових 40 маркерских гена).Додатна студија пет репрезентативних МАГ-ова 'Ца.Низак ниво загађивача у овим реконструисаним геномима потврђен је за врсте Еремиобацтерота коришћењем интерактивног интерфејса Анви'о заснованог на корелацијама у обиљу и саставу секвенце (додатне информације)59.
За филогеномску анализу одабрали смо пет репрезентативних МАГ-ова „Ца“.Еудормицробиацеае“, све врсте „Ца.Геном Еремиобацтерота и чланова друге врсте (укључујући УБП13, Арматимонадота, Патесцибацтериа, Дормибацтерота, Цхлорофлекота, Цианобацтериа, Ацтинобацтериа и Планцтомицетота) доступан је од ГТДБ (р89)13.Сви ови геноми су означени као што је претходно описано за екстракцију гена маркера једне копије и БГЦ белешке.ГТДБ геноми су конзервирани према горе наведеним критеријумима интегритета и контаминације.Филогенетска анализа је извршена коришћењем тока рада Анви'о Пхилогенетицс59.Стабло је конструисано коришћењем ИКТРЕЕ (в.2.0.3) (подразумеване опције и -бб 1000)80 на поравнању 39 тандем рибозомалних протеина које је идентификовао Анви'о (МУСЦЛЕ, в.3.8.1551)81.Његове позиције су смањене.да покрије најмање 50% генома82 и Планцтомицецота је коришћена као спољна група заснована на топологији ГТДБ стабла.Једно стабло од 40 усцМГ је направљено коришћењем истих алата и параметара.
Користили смо Траитар (в.1.1.2) са подразумеваним параметрима (фенотип, од нуклеотида)83 да бисмо предвидели уобичајене микробне особине.Истражили смо потенцијални предаторски начин живота заснован на претходно развијеном предаторском индексу84 који зависи од садржаја гена који кодира протеин у геному.Конкретно, користимо ДИАМОНД да упоредимо протеине у геному са ОртхоМЦЛ базом података (в.4)85 користећи опције –осећајнији –ид 25 –куери-цовер 70 –субјецт-цовер 70 –топ 20 И пребројамо гене који одговарају маркерски гени за предаторе и непредаторе.Индекс је разлика између броја предаторских и непредаторских ознака.Као додатну контролу, анализирали смо и „Ца“ геном.Фактор Ентотхеонелла ТСИ118 заснива се на његовој повезаности са Ца.Еудоремикробијум (велика величина генома и биосинтетски потенцијал).Затим смо тестирали потенцијалне везе између гена маркера предатора и не-предатора и биосинтетског потенцијала Ца.Еудормицробиацеае” и открили да се не више од једног гена (из било које врсте маркерског гена, тј. гена предатора/не-предатора) преклапа са БГЦ-ом, што сугерише да БГЦ не збуњује сигнале предаторства.Додатна геномска анотација кодираних репликона је изведена коришћењем ТКСССЦАН (в.1.0.2) да би се посебно испитао систем секреције, пили и флагелла86.
Пет репрезентативних 'Ца је мапирано мапирањем 623 метатранскриптома из фракција обогаћења прокариота и еукариота океана Таре22,40,87 (користећи БВА, в.0.7.17-р1188, -а флаг).Геном Еудормицробиацеае.БАМ датотеке су обрађене са ФеатуреЦоунтс (в.2.0.1)88 након 80% покривености читањем и 95% филтрирања идентитета (са опцијама феатуреЦоунтс –примарни -О –фрацтион -т ЦДС,тРНА -Ф ГТФ -г ИД -п ) Броји број уметака по гену.Генерисане мапе су нормализоване за дужину гена и обиље маркер гена мОТУ (дужином нормализован просечни број уметања за гене са бројем уметања >0) и лог трансформисане на 22,74 да би се добила релативна експресија по ћелији сваког нивоа гена, што такође објашњава варијабилност од узорка до узорка током секвенцирања.Такви односи омогућавају компаративну анализу, ублажавајући проблеме са саставом када се користе подаци о релативном обиљу.Само узорци са >5 од 10 мОТУ маркерских гена су узети у обзир за даљу анализу како би се омогућило откривање довољно великог дела генома.
Нормализовани транскриптомски профил 'Ца.Е. тараоцеании је подвргнут редукцији димензионалности коришћењем УМАП-а и резултујућа репрезентација је коришћена за ненадгледано груписање помоћу ХДБСЦАН (види горе) да би се одредио статус експресије.ПЕРМАНОВА тестира значај разлика између идентификованих кластера у оригиналном (не редукованом) простору удаљености.Диференцијална експресија између ових стања је тестирана у целом геному (види горе) и идентификован је 201 КЕГГ пут у 6 функционалних група, а то су: БГЦ, систем секреције и гени флагела из ТКСССЦАН, ензими разградње (протеазе и пептидазе) и предаторски и не- предаторски гени.предаторски индексни маркери.За сваки узорак израчунали смо средњу нормализовану експресију за сваку класу (имајте на уму да се сама експресија БГЦ израчунава као средња експресија биосинтетских гена за тај БГЦ) и тестирали значајност између стања (Крускал-Валисов тест прилагођен за ФДР).
Синтетички гени су купљени од ГенСцрипт-а, а ПЦР прајмери ​​су купљени од Мицросинтх-а.За амплификацију ДНК коришћена је Пхусион полимераза из Тхермо Фисхер Сциентифиц-а.За пречишћавање ДНК коришћени су НуцлеоСпин плазмиди, НуцлеоСпин гел и ПЦР комплет за пречишћавање из Мацхереи-Нагел.Рестрикциони ензими и Т4 ДНК лигаза су купљени од Нев Енгланд Биолабс.Хемикалије осим изопропил-β-д-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) (Биосинтх) и 1,4-дитиотреитола (ДТТ, АпплиЦхем) су купљене од Сигма-Алдрицх и коришћене без даљег пречишћавања.Антибиотици хлорамфеникол (Цм), спектиномицин дихидрохлорид (См), ампицилин (Амп), гентамицин (Гт) и карбеницилин (Цбн) су купљени од АпплиЦхем-а.Компоненте медија Бацто Триптоне и Бацто Иеаст Ектрацт су купљене од БД Биосциенцес.Трипсин за секвенцирање је купљен од Промега.
Секвенце гена су екстраховане из анти-СМАСХ предвиђеног БГЦ 75.1.Е. маласпинии (Допунске информације).
Гени ембА (локус, МАЛА_САМН05422137_МЕТАГ-фрамеворк_127-гене_5), ембМ (локус, МАЛА_САМН05422137_МЕТАГ-фрамеворк_127-гене_4), и ембАМ (укључујући секвенце, конструисане су као секвенце са геном 7 и без п-региона 7А) донс оптимизован за експресију у Е када.Ген ембА је субклониран у прво место вишеструког клонирања (МЦС1) пАЦИЦДует-1(ЦмР) и пЦДФДует-1(СмР) са БамХИ и ХиндИИИ местима цепања.Гени ембМ и ембМопт (оптимизовани кодоном) су субклонирани у МЦС1 пЦДФДует-1(СмР) са БамХИ и ХиндИИИ и смештени на друго место за вишеструко клонирање пЦДФДует-1(СмР) и пРСФДует-1(КанР) (МЦС2) са НдеИ/ЦхоИ.ембАМ касета је субклонирана у пЦДФДует1 (СмР) са БамХИ и ХиндИИИ местима цепања.Орф3/ембИ ген (локус, МАЛА_САМН05422137_МЕТАГ-скела_127-гене_3) је конструисан преклапајућим екстензијским ПЦР-ом коришћењем прајмера ЕмбИ_ОЕ_Ф_НдеИ и ЕмбИ_ОЕ_Р_КсхоИ, дигестираног са НдеИ/КсхоИ, дигестираног са НдеИ/КсхоИ мб (рестрикција са НдеИ/КсхоИ) у исти-пМЦ и рестриктивног-МЦХ1, јонски ензими (додатни сто).6).Варење и лигација рестрикцијским ензима је обављена према протоколу произвођача (Нев Енгланд Биолабс).